乐伐替尼联合依维莫司增强抗肿瘤活性的基础

　　在转移性肾细胞癌 ( RCC ) 的II期临床研究中，与依维莫司单药治疗相比，多受体酪氨酸激酶抑制剂乐伐替尼与哺乳动物雷帕霉素靶点 (mTOR) 抑制剂依维莫司的组合显着改善了临床结果。我们研究了临床前RCC模型中联合治疗抗肿瘤活性的潜在机制。乐伐替尼加依维莫司在三种人类肾细胞癌中显示出比任一单一疗法更强的抗肿瘤活性异种移植小鼠模型（A-498、Caki-1 和 Caki-2）。特别是，该组合导致 A-498 和 Caki-1 模型中的肿瘤消退。在 A-498 模型中，依维莫司显示出抗增殖活性，而乐伐替尼显示出抗血管生成作用。在 Caki-1 异种移植物中，乐伐替尼加依维莫司组合增强了抗血管生成活性，其中成纤维细胞生长因子 (FGF) 驱动的血管生成可能有助于肿瘤生长。该组合在血管内皮生长因子 (VEGF ) 激活中主要表现出加性活性，在细胞增殖和管形成测定中显示出对FGF激活的内皮细胞的协同活性，以及强烈抑制的mTOR-S6K-S6 信令。在携带过表达VEGF或FGF的人胰腺KP-1 异种移植物的小鼠中，也观察到该组合与每种单一疗法相比具有增强的抗肿瘤活性。我们的结果表明，乐伐替尼加依维莫司同时靶向肿瘤细胞生长和血管生成导致抗肿瘤活性增强。该组合增强了对VEGF和FGF信号通路的抑制作用，这是其在人类RCC异种移植模型中具有优异抗血管生成活性的基础。

　　我们在此表明，在三种人类 RCC 异种移植小鼠模型中，乐伐替尼与依维莫司的组合比任一单一疗法发挥更大的抗肿瘤活性。此外，乐伐替尼加依维莫司治疗导致三个模型中的两个（A-498 和 Caki-1）的肿瘤消退。然而，各种治疗对肿瘤微血管的影响在这两种模型中有所不同：乐伐替尼单药治疗能够降低两种模型中的 MVD，而依维莫司单药治疗仅导致 Caki-1 异种移植物的 MVD 降低。仅在该模型中也注意到了对 MVD 的组合效应。因此，在 Caki-1 模型中，该组合显示出更大的抗肿瘤活性是抗血管生成活性提高的结果，而在 A-498 模型中，这似乎是由于抗血管生成活性的组合乐伐替尼具有依维莫司的抗增殖活性。我们的数据表明，乐伐替尼加依维莫司在人类 RCC 模型中增强的抗肿瘤作用是通过两种不同的作用机制实现的。

　　VHL基因的突变是透明细胞 RCC 中最常见的遗传改变，即使在常氧条件下也会导致 HIF-1α 和 HIF-2α 的诱导。A-498 是 VHL 缺陷型 RCC 细胞系，而已知 Caki-1 表达野生型 VHL，表明无论 VHL 状态如何，乐伐替尼都可以发挥抗血管生成活性。尽管仅在具有野生型 VHL 的 Caki-1 异种移植物中观察到对肿瘤血管生成的联合作用，但我们在本研究中仅检查了少数细胞系，因此 VHL 状态与联合抗血管生成活性之间的关系值得进一步研究。

　　在 Caki-2 异种移植模型中，即使使用乐伐替尼加依维莫司，我们也没有观察到肿瘤消退。据报道，周细胞覆盖的血管对抗血管生成治疗具有相对耐药性，我们之前曾报道，在一组临床前肿瘤异种移植模型中，周细胞覆盖血管的百分比可能预测乐伐替尼的活性。6Caki-2肿瘤组织中基质细胞相对丰富，一般由癌相关成纤维细胞和壁细胞组成，大部分微血管位于基质区域（数据未显示）。因此，即使与依维莫司联合使用，Caki-2 异种移植物的肿瘤微环境状态也可能影响对仑伐替尼的敏感性，需要进一步研究以阐明潜在机制。

　　Lenvatinib 通过阻断 VEGFR 和 FGFR 来抑制 Erk1/2 和 S6K-S6 信号传导。相反，依维莫司影响 mTOR 通路而不影响 Erk1/2 的磷酸化，但完全抑制 S6K (Thr389) 的磷酸化，后者主要被 mTOR 复合物磷酸化。然而，依维莫司抑制的 S6K (Thr421/Ser424) 和 S6 (Ser235/Ser236) 的磷酸化作用弱于 S6K (Thr389)。相比之下，乐伐替尼加依维莫司的联合治疗对 mTOR-S6K-S6 通路，特别是 S6K (Thr421/Ser424) 和 S6 (Ser235/Ser236) 磷酸化有更大的抑制作用。先前的报道表明，在 mTOR 复合物的下游，S6K 和 S6 也可以被 Erk1/2 信号激活，分别在 Thr421/Ser424 和 Ser235/Ser236 残基处发生磷酸化。因此，除了依维莫司对 mTOR 的直接抑制外，对 S6K 和 S6 的更大抑制可能是由于乐伐替尼阻断了 S6K-S6 通路（mTOR 下游）中的 Erk1/2 交叉信号传导。总的来说，我们的结果表明，乐伐替尼对 MAPK 通路的抑制作用以及乐伐替尼加依维莫司对 mTOR-S6K-S6 通路的抑制作用增强了药物组合对 VEGF 和 FGF 驱动的血管生成的抑制作用。

　　越来越多的证据表明，FGF 作为促血管生成因子发挥作用，并且 FGF 信号通路的激活是逃避抗 VEGF 治疗的潜在机制，包括在 mRCC 中。鉴于：(i) FGF 介导的血管生成似乎在 Caki-1 异种移植模型中的肿瘤生长中起主要作用； (ii) lenvatinib 加依维莫司治疗导致该模型中的肿瘤消退;(iii)乐伐替尼是 FGF 信号传导的强抑制剂，我们假设乐伐替尼加依维莫司组合在 Caki-1 异种移植小鼠模型中的肿瘤消退至少部分是通过抑制 FGF 介导的血管生成介导的。乐伐替尼独特的激酶抑制特性，特别是其对 FGFRs 的抑制活性，可能使其能够克服 FGF 介导的 VEGF 信号抑制逃逸机制，并且可能至少部分地成为乐伐替尼联合依维莫司临床疗效的基础mRCC 患者。FGFR1 和 FGFR2 在 mRCC 中均过表达，并且 RCC 肿瘤细胞中的 FGF 信号传导也与恶性肿瘤和对 VEGFR 抑制的内在抗性有关。RCC 肿瘤细胞中 FGFR 和 mTOR 通路的联合靶向也可能是所观察到的乐伐替尼联合依维莫司临床活性的另一个机制。然而，由于乐伐替尼在 A-498 和 Caki-1 细胞增殖试验中的IC50值超过 5 μmol/L，我们推测乐伐替尼在这些细胞中缺乏直接的抗增殖活性。使用高度依赖于 FGF 信号传导的 RCC 细胞系和来自对 VEGF 靶向药物耐药的 RCC 患者的肿瘤组织样本进行的进一步实验，可能会对乐伐替尼加依维莫司组合的有效抗肿瘤活性产生更多的了解。

　　总之，我们为在临床前 RCC 模型中观察到的乐伐替尼加依维莫司组合的抗肿瘤活性提出了一个合理的生物学原理。我们假设这种联合治疗的活性增强是由于两种单独化合物的以下活性：（i）乐伐替尼和依维莫司相加或协同抑制 FGF 和 VEGF 诱导的血管生成；(ii) 乐伐替尼具有有效的抗血管生成活性，而依维莫司则发挥直接的抗肿瘤作用；(iii) 乐伐替尼和依维莫司协同抑制 FGF 驱动的肿瘤生长。通过使用分子靶向药物的组合来靶向多种致癌途径可以增强单一疗法的功效或克服与单一疗法相关的耐药性。我们在这里展示了乐伐替尼加依维莫司的组合靶向肿瘤细胞生长和血管生成。因此，与单独靶向肿瘤细胞以及有助于肿瘤微环境的非肿瘤细胞的药物联合治疗可能是有效抑制肿瘤的有力且有前景的概念。

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