为了确定在PDAC中激活的中性粒细胞中的潜在信号通路，并可能作为调节癌症中性粒细胞功能的治疗靶点，我们使用市售激酶分析阵列来监测196种酪氨酸诱饵肽的磷酸化。我们从健康小鼠中分离出BM，通过磁耗竭富集中性粒细胞，然后用来自胰腺癌细胞系KPC mT4（KPC-CM）的条件培养基刺激细胞1小时，并使用中性粒细胞蛋白裂解物进行激酶分析。基于肽磷酸化水平，通过基于组的预测系统预测相应激酶的活性.我们发现非受体酪氨酸激酶FES，BTK，JAK1，EphA8和EphB1在KPC-CM刺激的中性粒细胞中被激活。JAK或BTK信号传导的抑制先前已在临床前PDAC模型中得到证实.我们还从KPC小鼠模型中分离了骨髓中性粒细胞（KrasLSL-G12D/+;Trp53LSL-R172H/+;Pdx1-Cre）与胰腺肿瘤，并证明与来自无肿瘤对照小鼠的中性粒细胞相比，FES是活性显着增加的激酶组之一有趣的是，最近有报道称，劳拉替尼（PF-06463922）是FDA批准的ALK抑制剂，可有效抑制FES.为了测试劳拉替尼是否可以抑制中性粒细胞中的FES活性，我们在劳拉替尼或载体存在下用KPC-CM刺激中性粒细胞1小时，并使用分析阵列来确定激酶活性。我们发现劳拉替尼基于阵列中诱饵肽的磷酸化模式降低了FES的活性。
劳拉替尼（Lorlatinib）可以抑制PDAC细胞激活中性粒细胞中的FES激酶
假设劳拉替尼抑制FES信号传导会导致STAT蛋白磷酸化减少。事实上，当我们在用KPC-CM刺激的中性粒细胞中加入劳拉替尼时，我们观察到STAT5的磷酸化减少，而STAT3的磷酸化没有观察到变化。我们确定Fes在原位PDAC肿瘤的CD11b +分选髓系细胞中表达。我们通过分析从KPC小鼠模型中的胰腺肿瘤中分选的中性粒细胞（Ly6G）、单核细胞（Ly6C）和巨噬细胞（F4/80）中的Fes表达，进一步证实了Fes在中性粒细胞中的表达水平最高。为了确定劳拉替尼如何调节中性粒细胞，我们通过将新鲜分离的BM中性粒细胞接种在转孔插入物中，将KPC-CM作为化学引诱剂接种在底部室中来测试中性粒细胞迁移。我们观察到，与载体相比，劳拉替尼减少了响应KPC-CM的中性粒细胞迁移。为了探索劳拉替尼治疗的中性粒细胞对癌细胞生长的影响，我们在劳拉替尼或载体存在下，在KPC-CM中培养表达zsGreen的KPC mT4细胞和新鲜分离的BM中性粒细胞。共培养2天后，我们固定细胞并量化zsGreen细胞的数量。
虽然我们没有看到劳拉替尼对没有中性粒细胞存在的zsGreen+细胞数量有任何影响，但我们发现与载体相比，劳拉替尼减少了中性粒细胞共培养物中KPC mT4细胞的数量.我们使用细胞活力测定确认劳拉替尼不会抑制KPC细胞的增殖。最后，为了确认劳拉替尼对中性粒细胞功能的影响不是由直接诱导细胞死亡引起的，我们分离了BM中性粒细胞，并在细胞培养2天后在劳拉替尼存在下测定了它们的活力。如前所述，中性粒细胞活力在常规细胞培养基中下降非常快，在第2天无法检测到。然而，当细胞在KPC-CM，GM-CSF或G-CSF中培养时，我们能够挽救中性粒细胞活力。重要的是，在任何一种情况下，劳拉替尼的存在都不会降低中性粒细胞的活力。综上所述，这些结果表明PDAC细胞在体外诱导中性粒细胞中的FES活性，并且劳拉替尼可用于靶向PDAC中的肿瘤相关中性粒细胞。
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