对TZM-b1细胞进行了体外时间依赖性药物吸收/保留研究。在孔板中接种TZM-b1细胞。治疗组用10μg/ mL的TAF+FTC NP或TAF+FTC溶液处理24小时。对于时间依赖性摄取研究，在各自的时间1、4、8和16h（在处理冲洗前），将各自的板用温1xPBS洗涤，并按照以下说明进行处理。但是，为进行保留研究，在处理24小时后，将TAF+FTC NP或溶液用温热的1×PBS（三次）洗去，并保存在新鲜的完整HiDMEM中，即补充有10％FBS和1x抗生素-抗真菌药的hiDMEM。 直到相应的收获时间（清洗后的1、4、8、16、24和96小时，分别对应于25、28、32、40、48和120小时）。
在各个时间点，再次用1×PBS洗涤细胞。洗涤后，将板在生物安全柜中风干，并保存在-80°C下直至分析。如下文LC-MS / MS部分所述对样品进行进一步处理并通过方法进行分析.CD34+人源化NOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1Wjl / Szj小鼠（hu-CD34-NSG）杰克逊实验室将用于PK研究。它与用于PrEP研究的hu-BLT小鼠极为相似。在实验开始之前，使小鼠适应一周。此外，ARV NP和ARV溶液治疗组中的所有小鼠分别接受皮下（SubQ）TAF+FTC NP和TAF + FTC溶液（TAF和FTC各自为200mg/kg）。将TAF+FTC NP悬浮在0.6 mL的5％葡萄糖中。在TAF+FTC NP后处理（PT）后的1、2、4、7、10和14天后的1、4和12小时，通过吸入二氧化碳处死小鼠（n = 3 /时间点）和颈椎脱位。类似地，在200、8、24、48和72小时处死接受200 mg / kg TAF + FTC溶液SubQ的小鼠（n = 3 /时间点）。从所有处死的小鼠中收集包括阴道和结肠在内的血液和器官。
将血液收集到装有收集管的乙二胺四乙酸二钾（K2EDTA）中，以2100 RPM离心20分钟，收集血浆并冷冻直至通过LC-MS / MS分析。根据制造商的规程，通过Ficoll-Paque密度梯度分离方法从全血中分离外周血单核细胞（PBMC），并将其冷冻直至通过LC-MS / MS分析。从血浆和组织中分析了TFV和FTC，而从PBMC中分析了活性代谢产物。 Phoenix WinNonlin用于使用非房室分析来确定血浆的PK参数和组织浓度-时间数据。这些组织浓度-时间数据用于确定感染部位和相关组织在特定时间的TFV和FTC的量。
按照我们先前报道的方法分析血浆和组织的TFV和FTC浓度。简而言之，将100μL血浆或组织匀浆（使用钛珠以去离子[1：1 w / v]匀浆）与25μL内标加标溶液混合，然后混合100μL1％三氟乙酸。将样品涡旋并放入固相萃取（SPE）柱中。洗脱液在氮气流下蒸发至干，用100μL的50％ACN水溶液重构，并将5μL注入LC-MS / MS仪器。使用色谱柱进行色谱分离，等度流动相由0.1％甲酸的水溶液（A）和0.1％甲酸的乙腈组成，流速为0.250 mLmin。对于TFV和FTC，验证试验的动态范围为1至2000 ng / mL。
对于TFV-dp和FTC-三磷酸（FTC-tp）分析，将500μL70％的甲醇水溶液添加到PBMC沉淀（约106个细胞）中，涡旋，超声处理并离心。将200微升上清液与50μL内标加标溶液（1μg/ mL 2-氯腺苷三磷酸和250 ng / mL TFV腺嘌呤13C混合，在45°C蒸发至干并用100μL2mM甲酸铵重构将含有0.05％v / v三乙胺的5μL样品注入以负模式运行的LC-MS / MS。使用具有等度流动相的Kinetex C18（75×4.6 mm，2.6μ）色谱柱，以0.25 mLmin的流速包含2mM甲酸铵+ 0.05％三乙胺：ACN（95：5）。两种分析物的动态校准范围为1至1000 ng。
为了进行体外细胞内TFV，FTC，TFV-dp和FTC-tp测定，加入60μL水中的0.5％乙二胺四乙酸（EDTA）并涡旋以使细胞与孔板分离。向分离的细胞中加入140μL甲醇以裂解细胞。将孔板涡旋，将内容物在4°C下以14000 rpm离心5分钟。 那么现在taf哪能买到？价格是多少？更多详情可咨询下方微信。
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