法匹拉韦是一种对甲型流感病毒(一种远亲正粘病毒科成员)有效的药物,通过抑制其RNA依赖性RNA聚合酶起作用。由于BRBV是正粘病毒科的成员,我们假设法匹拉韦可能对BRBV具有抗病毒活性。为了测试这一点,我们在存在或不存在 100 μg/mL 法匹拉韦的情况下进行了病毒生长测定,并通过病毒滴定测定法 (TCID) 每 24 小时 (h) 测量培养物上清液中的病毒滴度 4 天50/毫升)。没有法匹拉韦,BRBV-STL增长到~108TCID50/毫升在 4 天内。相反,感染后立即加入药物可抑制培养上清液中病毒的产生近一百万倍.在这种剂量的法匹拉韦下,Vero细胞的活力受到的影响最小.
接下来,我们确定了最小有效浓度(EC50)法匹拉韦对BRBV-STL。Vero细胞在不同浓度的法匹拉韦存在下感染BRBV-STL。在感染后72小时收集培养上清液(hpi),并通过斑块测定(pfu/mL)定量病毒滴度。在100和300μg/mL(0.64和1.9mM)浓度的法匹拉韦;不影响Vero细胞活力的浓度.在30 μg/mL或更低浓度.根据这些数据,欧共体50法匹拉韦对BRBV的计算为~48μg/mL(0.31mM)。
为了确认法匹拉韦靶向BRBV-STL的聚合酶复合物,我们开发了一种用于BRBV-STL的微型基因组报告基因测定。转染293T细胞,其中含有编码PB2、PB1、PA和NP蛋白的表达质粒,加上萤火虫-荧光素酶报告基因,可产生强大的萤火虫-荧光素酶活性.该活性对BRBV的聚合酶复合物具有特异性,因为去除必需聚合酶基因PB1不会导致报告活性。该测定用于量化法匹拉韦对BRBV复制的抑制作用。与模拟处理的对照相比,BRBV-STL的聚合酶活性在100、30、10、3和1μg/mL(640-6.4μM)浓度下显著降低(P <0.001);欧共体50值计算为 1 μg/mL (6.4 μM)。
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