肾上腺皮质癌对米托坦(Mitotane)治疗的生物学反应

　　先前的病例报告描述了最初被误诊为肾上腺皮质癌 (ACC) 的肾上腺偶发瘤，使用米托坦（Mitotane）治疗。最终诊断为原发性不明的转移性黑色素瘤。然而，该患者在米托坦停药后疾病进展迅速，这表明米托坦在非肾上腺源性肿瘤中具有保护作用。本研究的目的是确定从该患者获得的原发性黑色素瘤细胞以及其他已建立的黑色素瘤和 ACC 细胞系对米托坦治疗的生物学反应，使用增殖测定、流式细胞术、定量 PCR 和微阵列。尽管米托坦抑制 ACC 和黑色素瘤细胞的增殖，但它在黑色素瘤治疗中的作用似乎有限。体外。Mitotane 改变了几个关键生物过程的活性，包括“有丝分裂核分裂”、“DNA 修复”、“血管生成”和“ERK1 和 ERK2 级联的负调控”。米托坦给药导致 DNA 双链断裂、坏死和细胞凋亡水平升高。本研究在分子水平上提供了对米托坦处理细胞的生物学反应的全面了解。值得注意的是，本研究结果提供了关于米托坦对 ACC 和黑色素瘤细胞影响的新知识。

　　在我们之前的研究中，一名患者被诊断为左肾上腺原发性不明的转移性黑色素瘤，并接受了米托坦（Mitotane）治疗。随访时，肾上腺床未见复发迹象。在米托坦停药后 3 个月的随访中，发现了多处转移。因此，在本研究中，使用 HAC15（肾上腺癌）和 WM266-4（转移性黑色素瘤）细胞系以及源自先前描述的患者的原发性黑色素瘤细胞系在体外模型上进行了实验。目前的研究有三个主要目的：i）评估米托坦对所研究细胞增殖率的影响；ii) 检查与 DDR 机制有关的大量蛋白质和基因的表达；iii) 研究处理细胞的基因表达谱。

　　HAC15 细胞系构成了定义调节醛固酮和皮质醇产生的分子机制的合适模型，可应用于正常肾上腺细胞功能或 ACC 的研究。此外，与常用的 NCI-H295R 细胞系不同，HAC15 细胞系对所有主要的肾上腺促分泌素如血管紧张素 II、K+和促肾上腺皮质激素 (ACTH) 的刺激都有反应，从而刺激肾上腺激素的生物合成。因此，这种细胞系似乎密切反映了肾上腺生理学，并被广泛用于研究。此外，目前的微阵列结果证实了 HAC15 系中关键的肾上腺类固醇生成基因的高表达，以及其对 ACTH 和毛喉素刺激的敏感性。

　　Poli等人在米托坦（Mitotane）浓度增加的情况下培养 NCI-H295R 细胞。米托坦（Mitotane）处理以剂量和时间依赖性方式减少细胞数量，这归因于对细胞活力和增殖的抑制作用。数据显示，治疗窗口 (30–50 μM) 中的米托坦水平发挥了与抑制细胞增殖相关的细胞毒性作用。本研究还表明，米托坦可降低 ACC 和黑色素瘤细胞的增殖率。这种效应是剂量依赖性的 (10–80 μM)，在原发性黑色素瘤细胞中尤为明显，即使在低浓度的米托坦下，增殖抑制也很明显。在改变培养基（在对照组中）或给予所研究的药物后，通常会观察到阻抗的快速下降，然后稳定下来。此外，在 WM266-4 细胞的情况下，该图在 y 轴上显示较小的范围，这导致在各个值处形成不太明显的增殖曲线。

　　Seidel等人生成了一个抗米托坦 HAC15 细胞系，发现抗性克隆在治疗过程中能够维持正常的线粒体和核仁形态。除其他因素外，耐药性归因于细胞内脂质稳态的改变和类固醇产生的减少。这一发现与本研究结果一致，表明线粒体完整性在对米托坦治疗的反应中起着至关重要的作用。Bikas等人使用与本研究中相同的浓度 (50 μM) 和时间点 (24 h) 检查了米托坦（Mitotane）对不同组织学亚型甲状腺癌的影响。该研究观察到，用米托坦处理促进了 DSBs 并激活了细胞凋亡过程，同时还降低了线粒体膜电位。与这些报道一致，本研究还发现，基于反映 DSB 和细胞凋亡的流式细胞术，米托坦处理的肾上腺细胞表现出更高水平的组蛋白 γH2AX 表达和切割 PARP-1。Cerqueti等人发现米托坦干扰了两种 DNA 错配修复蛋白酶（DNA 错配修复蛋白 MSH1 和 DNA 错配修复蛋白 MSH2）的调节，这两种酶是错配 DNA 修复机制的一部分，这可以解释放射增敏特性米托坦。在目前的研究中，米托坦治疗促进了许多参与 DSB 修复的基因的表达，包括 BRCA2、XRCC4 和 RAD51。重要的是，这些基因根据细胞类型上调或下调，表明 ACC 和黑色素瘤细胞似乎在不同水平上促进了不同的 DNA 修复机制。

　　总之，本研究旨在阐明常规用于治疗 ACC 的米托坦（Mitotane）影响其他细胞类型的机制。目前的体外研究结果表明，米托坦对黑色素瘤的疗效不如对肾上腺癌的疗效。在本研究中，米托坦对人类 ACC 细胞系的影响最大，其次是对已建立的转移性人类黑色素瘤细胞系的中等影响。在源自转移性人黑色素瘤的细胞系中，对米托坦的反应是中等的。这三种细胞系在对米托坦的反应强度（原发性转移性黑色素瘤细胞系<已建立的转移性黑色素瘤细胞系<人肾上腺癌细胞系）以及它们对不同信号通路的激活方面存在差异。

　　需要强调的是，本研究报告的患者在肾上腺表现出转移性黑色素瘤，对米托坦（Mitotane）治疗反应良好，这一真实世界的证据优于体外实验得出的结果，包括在目前的研究。因此，很难阐明米托坦影响不同细胞类型的机制，因此需要进一步研究。总之，本研究详细描述了似乎响应米托坦治疗而被激活的机制。微信扫描下方二维码了解更多：