BCR-ABL1复合突变体对帕纳替尼(Ponatinib)表现出差异

　　第三代酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 帕纳替尼（Ponatinib）在慢性粒细胞白血病 (CML) 的各个阶段以及费城 (Ph) 阳性急性淋巴细胞白血病 (ALL) 中均发挥强大的抗肿瘤作用。它能够抑制 BCR-ABL1 在酪氨酸激酶结构域 (TKD) 中携带任何单一突变的激酶活性，包括看门人突变 T315I。然而，如果该 TKI 的 IC50值超过可达到的最大有效血浆水平，那么携带BCR-ABL1变体的亚克隆中可能会产生对帕纳替尼的耐药性，该变体在同一等位基因上具有两个或多个突变。这些所谓的复合突变 (CM) 代表了对所有当前可用的 TKI 的强大耐药机制。我们的数据表明，个别 CM 对帕纳替尼具有高耐药性，因此排除了这种特殊 TKI 的临床使用。然而，一些 CM 仅显示出对帕纳替尼的低至中等耐药性，这表明只要应用适当的给药方案，成功抑制突变亚克隆是可行的。

　　CML 中 CM 的发生主要与使用不同 TKI 的序贯治疗有关，并且在 Ph 阳性 ALL 中更常见。尽管 CM 被建议在 CML 的慢性期不会对帕纳替尼产生原发性/继发性耐药性，但它们仍然是 CML 和 Ph 阳性 ALL 晚期的主要问题。因此，确定他们对帕纳替尼的反应性对于随后的临床管理至关重要。然而，使用帕纳替尼（Ponatinib）治疗可能会产生严重的副作用，和关于明显剂量依赖性严重不良事件的报告为将推荐的每日剂量从 45 mg 减少到 30 甚至 15 mg 提供了基础。给药方案中的这些修改意味着可实现的帕纳替尼有效平均血浆浓度 (efCave) 水平分别从 28 nM 降低至 23 nM 和 10 nM。在这方面，严格的体外分析CM对帕纳替尼（Ponatinib）的反应可以评估临床环境中所需的有效剂量。这一观点得到了在 Ponatinib Ph 阳性 ALL 和 CML 评估 (PACE) 试验中接受治疗的三名 CM F317L/E459K 患者的示范课程的支持，该试验是一项使用帕纳替尼（Ponatinib）在严重预处理的耐药或不耐受 Ph 患者中进行的 2 期临床研究-阳性白血病。每天接受 42 和 45 毫克（efCave ~26 和 28 nM）的两名患者分别在 168 和 87 天内实现了持久的主要分子反应（MMR），而另一名患有这种 CM 的患者接受了平均每日剂量32 mg（对应于 ~24 nM 的 efCave），需要 583 天才能达到 MMR，并在达到此目标后 82 天退出研究。后一种观察结果与帕纳替尼剂量不足的情况一致，但有必要考虑缓慢反应可能归因于突变独立机制的可能性。

　　为了评估基于体外测试对帕纳替尼的预期反应，我们将一组 28 个 BCR-ABL1 CM 以及各种单突变作为对照引入 Ba/F3 细胞。选择这种细胞背景是因为已在该模型中建立了大多数已发表的表明单个BCR-ABL1突变的 TKI 反应的热图。我们最近发表的观察结果表明，早期报告中提出的一些突变对 TKI 抗性的体外数据可能被高估了。这可能是由于测试细胞无意中在基因组中携带了多个突变BCR-ABL1盒插入物。因此，我们建立了一种基于转座子的方法来快速有效地转染突变BCR-ABL1构建到细胞中，并实施了流式细胞术辅助选择方法，促进靶向富集在基因组中携带单基因构建插入的细胞。该协议被证明可提供与在患者标本中观察到的相似的BCR-ABL1表达水平，并允许在体外对 TKI 敏感性进行无偏见的测试。

　　帕纳替尼（Ponatinib）的IC50值是通过采用广泛使用的体外增殖测定来确定的。大多数涉及先前没有证据表明对帕纳替尼耐药的部位的 CM 显示 IC50值低于 10 nM。这种 efCave 很容易通过每天 15 毫克的帕纳替尼剂量实现，因此表明对这种 TKI 治疗的高度敏感性。这一发现支持了 CM 不一定对帕纳替尼产生耐药性的观点，除非包括 T315 和 F317 在内的特定位点特别受到影响。CM 显示体外对帕纳替尼的耐药性升高几乎总是包括这两个位点的突变。事实上，在测试的面板中，唯一一个既不携带 T315I 也不携带 F317L 且对帕纳替尼敏感性降低的 CM 星座是 Y253H/F359V，IC50值为 23.7 ± 1.7 nM。这一体外评估得到了 PACE 试验中临床观察的支持：一名 CML 患者在接受帕纳替尼治疗前出现 V299L/F359V，该星座显示该 TKI 的 IC50在 10 nM 范围内。然而，患者在平均每日 26 mg 的帕纳替尼剂量下表现出疾病进展的迹象，对应于 ~20 nM 的 efCave。此时的突变分析显示 Y253H/F359V 显示出对帕纳替尼（Ponatinib）的 IC50值超出了该患者明显达到的 efCave。因此，可以想象，ponatinib 的实际剂量可能不足以抑制 BCR-ABL1Y253H/F359V的激酶活性，从而导致疾病进展。竞争性体外共培养实验表明，表达 BCR-ABL1Y253H/F359V的 Ba/F3 细胞比携带 BCR-ABL1V299L/F359V的 Ba/F3 具有增殖优势在 20 nM 的帕纳替尼存在下，而在 30 nM 的帕纳替尼浓度下观察到两种细胞系的存活率显着降低。这个例子强调了通过考虑在开始治疗之前或治疗期间确定的突变的 IC50来选择适当剂量的帕纳替尼的潜在相关性。然而，有必要考虑的是，突变亚克隆的流行率在疾病晚期会升高，在这种情况下通常可能需要更高剂量的帕纳替尼，以防止克隆选择和扩增，即使不存在适合于通过目前可用的方法进行检测。

　　与早先的报道一致，涉及 T315I 突变的 CM 对帕纳替尼显示出最高的 IC50值，明显超过了该药物临床可达到的血浆浓度。这些突变群包括 T315I 与 P 环突变 G250E 和 E255V 以及 T315I/F359V 的组合，它们在用帕纳替尼治疗期间出现，如前所述。我们对这些 CM 的分析也表明对帕纳替尼具有高水平的耐药性，但确定的 IC50值低于先前报道的可以想象，由于上述技术原因。除了已经显示出对帕纳替尼具有抗性的星座外，我们还鉴定了涉及 T315I 的 CM 和显示非常不同功能特性的位点的残基，这也显示出帕纳替尼的 IC50值明显高于 28 nM 的 efCave。受影响的其他位点包括南叶突变 E459K 和 A 环突变 L384M、L387M 和 H396R。与 A 环突变类似，有人提出 E459K 突变使 ABL1 TKD 的非活性构象不稳定。这种功能特性可能起关键作用，因为帕纳替尼是一种 II 型 TKI，主要与 BCR-ABL1 TKD 的非活性构象结合因此需要相当高浓度的药物才能抑制激酶活性。建议使用 CM T315I/L384M 并在体外证实可在临床可达到的血浆水平上赋予对帕纳替尼的耐药性，但迄今为止尚未在 Ph 阳性白血病患者中报道这种情况。相比之下，在临床环境中已观察到复合突变 T315I/L387M、T315I/H396R 和 T315I/E459K，但对帕纳替尼的易感性仅通过T315I/H396R的体外分析来表征。有趣的是，CM T315I/H396R 显示出对阿西替尼的敏感性，一种食品和药物管理局 (FDA) 批准的血管内皮生长因子受体 (VEGFR) 抑制剂，它也显示出对 BCR-ABL1T315I 突变体的活性。同样，我们证明了将 T315I 与 A 环突变结合的其他 CM，包括 T315I/L384M、T315I/L387M 和 T315I/E459K，对阿西替尼的反应 IC50值 <100 nM，表明对这种药物有临床敏感性。然而，临床可达到浓度的阿西替尼对影响 F317 位置的耐帕纳替尼（Ponatinib） CM 无效。

　　使用帕纳替尼（Ponatinib）治疗与相当大的心血管毒性和其他似乎与剂量相关的潜在严重副作用有关。然而，正如所提供的数据所强调的那样，当前旨在降低帕纳替尼剂量的策略应仔细考虑BCR-ABL1TKD 中突变的存在和类型，以实现有效治疗。因此，非常需要对有效血浆药物浓度进行测试并监测突变亚克隆的动力学，此外还包括复合突变在常规诊断监测中，为优化接受帕纳替尼治疗的患者的临床管理提供基础。然而，尽管有所有证据表明突变在限制 TKI 治疗效果方面的重要作用，但目前的实验和诊断证据仍未确定的其他耐药机制可能在突变 BCR-ABL1 细胞中起作用，并可能影响对治疗的临床反应。

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