高剂量米哚妥林(midostaurin)脉冲处理的效果

　　在急性髓性白血病 (AML) 中，约 30-35% 的患者发现了激活的FLT3突变。最常见的突变类型以内部串联重复 (FLT3-ITD) 为代表，通常位于近膜结构域或酪氨酸激酶结构域 1内。FLT3-ITD 导致组成性激活的细胞内信号传导，导致恶性转化。几种 FLT3-TKI 目前正处于临床开发阶段，显示出作为单一疗法的短期生物学和临床活性。据报道，索拉非尼联合标准化疗可改善年龄 <60 岁的非选择性 AML 患者的无事件生存率，最近的报告强调了米哚妥林（midostaurin）联合标准化疗对FLT3突变 AML 的疗效。Midostaurin 是星形孢菌素的多激酶抑制剂衍生物，对几种激酶具有活性，包括 FLT3、KIT、PKC 酶家族的一些成员、KDR 和 PDGFR-β。最近报告的一项国际、随机、安慰剂对照的 III 期临床试验 (RATIFY) 的结果惊人地表明，在接受新诊断的FLT3突变的 AML 治疗的 18-60 岁的成年人中，总体和无事件生存率显着提高且具有临床相关性除了标准化疗外，使用米哚妥林（midostaurin）。这种生存益处可能会导致在不久的将来批准 midostaurin 用于治疗FLT3突变的 AML。

　　为了研究高剂量米哚妥林（midostaurin）脉冲处理的效果，我们检测了用突变FLT3-ITD (Ba/F3-FLT3-ITD)稳定转染的造血小鼠 Ba/F3 细胞 (DSMZ, Braunschweig, Germany) 诱导的凋亡细胞死亡。.为了排除细胞环境特异性现象，在表达人骨髓单核细胞 MV4-11 白血病细胞（DSMZ，Braunschweig，Germany）的突变 FLT3-ITD 中进行了类似的实验。用不同生物学相关浓度的米哚妥林（midostaurin）处理细胞2小时（即 35、100 和 3500 nM），进行广泛洗涤然后在不含 TKI 的细胞培养基中维持共 24 小时。未处理的细胞和用上述浓度的米哚妥林（midostaurin）连续处理的细胞作为对照。使用 3500 nM midostaurin 对 Ba/F3-FLT3-ITD 细胞进行高剂量脉冲暴露（2 小时）导致 24 小时 >80% 的细胞凋亡，而相比之下，分别使用 35 和 100 nM midostaurin 处理 2 小时，没有增加细胞凋亡水平。通过使用 Ba/F3-FLT3-野生型细胞作为对照，排除了由 midostaurin 的脱靶活性介导的影响。在此控制设置中，在任何测试的米哚妥林（midostaurin）浓度下，脉冲暴露 2 小时后未检测到细胞凋亡增加（数据未显示）。有趣的是，Ba/F3-FLT3-ITD 细胞中的半胱天冬酶 3 切割动力学在使用的不同 midostaurin 浓度下是相似的，这表明在暴露于低或高米哚妥林（midostaurin）浓度的细胞中发生凋亡诱导的共同特定机制，因此证实了先前的发现用 BCR-ABL TKI 获得。

　　然后，我们采用了我们之前开发的实验设计，包括重复洗涤和重新电镀程序，以证明高剂量 TKI 脉冲暴露后细胞内药物的积累和保留。以 2 小时的间隔进行三轮连续的彻底培养基交换（每轮由 2 次药物洗出），然后在 24 小时测量凋亡细胞死亡。未处理的细胞与来自三个相应洗涤步骤的上清液一起温育。与上述数据一致，在两种FLT3突变细胞系中，高剂量米哚妥林（midostaurin）脉冲暴露在 24 小时终点诱导凋亡细胞死亡。然而，当第二次（初始培养基交换后 2 小时）和第三次（初始培养基交换后 4 小时）彻底清洗细胞时，这种效果在很大程度上被消除，我们观察到凋亡细胞死亡仅略有增加。基线凋亡水平。将先前未处理的细胞与来自第二次培养基交换 (S2) 的细胞培养上清液一起孵育导致凋亡细胞比例显着增加。

　　在 BCR-ABL 阳性细胞中，我们和其他人已经证明 STAT5 和 ERK 磷酸化的抑制程度表明存在功能相关水平的 TKI。类似地，STAT5 信号传导在 FLT3-ITD 阳性细胞中异常激活，并在这些细胞中提供重要的存活信号。因此，我们研究了 STAT5 和 ERK 响应高剂量 米哚妥林（midostaurin）脉冲暴露的磷酸化动力学。在高剂量米哚妥林（midostaurin）脉冲暴露 (1 ×) 后第一轮药物洗出后，观察到磷酸化 ERK 和磷酸化 STAT5 完全不存在。然而，与我们关于诱导细胞凋亡的结果一致，我们观察到在第二轮药物洗脱（2×）后磷酸化ERK和磷酸化STAT5信号逐渐重新出现，在第三轮（3×）培养基交换时磷酸化信号几乎完全恢复。

　　为了测试米哚妥林（midostaurin）是否从处理过的细胞重新分布到细胞外培养基中，通过具有二极管阵列和荧光检测器的高效液相色谱法测定细胞上清液中米哚妥林（midostaurin）的浓度。Ba/F3-FLT3-ITD 细胞以及来自两名 AML 患者和正常 CD34+ 细胞的白血病原始细胞用于该分析。高剂量midostaurin（3500 nM）脉冲暴露（2小时）后彻底清除药物，并在药物清除后的几个时间点（0、15、30、60和120分钟）测量细胞培养基中的midostaurin浓度）。细胞培养物上清液中的咪达霉素浓度随时间增加，这证明咪达霉素从处理过的细胞释放到培养基中。在初始药物洗出后 15 分钟，在 120 分钟后，细胞培养基中的米哚妥林（midostaurin）浓度达到 Ba/F3-FLT3-ITD 细胞的半数最大抑制浓度 (IC50) 并达到 >100 nM，对应于约 3 × IC50。在测试的不同细胞类型中，再分布动力学高度相似。

　　总之，这些数据表明高剂量脉冲暴露后细胞内米哚妥林（midostaurin）积累，随后随着时间的推移缓慢释放到细胞外介质中，其方式类似于 BCR-ABL TKI 所描述的方式。微信扫描下方二维码了解更多：