尼达尼布和吡非尼酮对成纤维细胞和肌成纤维细胞结构和功能的影响

　　特发性肺纤维化（IPF）是一种预后不良的无法治愈的肺部疾病。成纤维细胞和肌成纤维细胞是纤维化过程中的关键细胞。最近两种药物吡非尼酮和尼达尼布被批准用于临床，因为它们能够减缓疾病进展。这两种药物在体外细胞系统中的作用机制尚不清楚。因此，本研究的目的是检查吡非尼酮和尼达尼布对患有或未患有 IPF 患者的成纤维细胞和肌成纤维细胞结构和功能的影响。

　　方法

　　从对照肺 ( n = 4) 或 IPF (n = 7)收集和培养基质细胞。用吡非尼酮和/或尼达尼布处理细胞，通过蛋白质分析和/或免疫电子显微镜测量细胞增殖、α-平滑肌肌动蛋白 (α-SMA) 和纤连蛋白表达、透射电子显微镜的超微结构特性和通过胶原凝胶收缩和侵袭测定的功能特性。

　　结果

　　吡非尼酮和尼达尼布均以剂量依赖性方式降低成纤维细胞的体外增殖。 1 mM 吡非尼酮使对照肺的细胞数量减少到 47 % (p = 0.04) 和 IPF 细胞数量减少到 42 % (p = 0.04)，相应地减少到 67 % (p = 0.04) 和 68 % (p = 0.04 )，1 μM 尼达尼布。如果两种药物一起使用，则观察到增殖进一步减少。吡非尼酮和尼达尼布都能够减少 α-SMA 的量和肌纤维母细胞的外观，尽管减少的程度取决于细胞系。在功能测定中，两种药物的效果也各不相同。

　　结论

　　我们得出结论，成纤维细胞和肌成纤维细胞的超微结构和功能受到吡非尼酮和尼达尼布的影响。药物的组合比单独使用任何一种药物更能减少细胞增殖。人肺衍生细胞培养系统代表了筛选和测试纤维化疾病药物的潜在平台。

　　我们的研究表明，吡非尼酮和尼达尼布的效果都可以在来自对照或 IPF 肺的培养细胞上进行评估。这些药物不仅影响细胞的增殖速度，还抑制肌纤维母细胞的超微结构特征，影响三维胶原凝胶的收缩和细胞的侵袭能力。最初肌成纤维细胞是在对愈合伤口进行 EM 调查时发现的。尽管 α-SMA 是肌成纤维细胞最常见的标志物，但它并不具有特异性，因为已知其他类型的细胞（如平滑肌细胞）表达 α-SMA。到目前为止，没有可用于肌成纤维细胞的特定标记，因此仍需要进行 EM 评估以最终识别该细胞群。肌成纤维细胞的一个典型超微结构特征是纤维连接 (FNX)，它由细胞内 α-SMA 和相关的细胞外纤连蛋白组成。据我们所知，这是第一项研究，其中从 IPF 患者培养的肌成纤维细胞已通过 TEM 和 IEM 在实验诱导模型中以 FNX 为重点进行检查，其中包括暴露于抗纤维化药物。

　　先前关于吡非尼酮或尼达尼布的许多研究都是使用博莱霉素诱导的实验动物（如小鼠和仓鼠）的纤维化模型进行的。这些表明，吡非尼酮降低了羟脯氨酸水平，并降低了肺纤维化程度和肌成纤维细胞的数量。Nakayama 和同事使用商业人类成纤维细胞并指出吡非尼酮在 TGFβ 治疗后降低了热休克蛋白 47 (HSP47) 和胶原蛋白 I 的表达。Conte 及其同事报告说，从人肺收集的原代成纤维细胞在体外对吡非尼酮有反应。已发现吡非尼酮可降低成纤维细胞增殖、TGFβ 诱导的 α-SMA 和前胶原-I mRNA 和蛋白水平，并且还抑制 TGFβ 通路中因子的表达。类似地，已经表明吡非尼酮抑制胶原凝胶收缩和 TGFβ1 诱导 α-SMA 产生瘢痕疙瘩衍生的成纤维细胞。所有上述研究的结果都与现有数据一致并得到支持，这些数据表明吡非尼酮降低了细胞的收缩能力、侵袭和增殖，以及通过西方分析评估的由成纤维细胞和肌成纤维细胞。此外，我们的研究结果通过 IEM 和 TEM 对单个肌成纤维细胞的检查得到证实，其中肌成纤维细胞的典型超微结构特征在暴露于尼达尼布或吡非尼酮后减弱。

　　在本研究中，尼达尼布和吡非尼酮均能抑制 TGFβ1 诱导的肌成纤维细胞转化。先前已经表明，尼达尼布可以同时抑制几种靶点，即血小板衍生生长因子（PDGF）、血管内皮生长因子（VEGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）。先前两项检查尼达尼布的研究使用了博来霉素诱导的大鼠纤维化模型和从 IPF、结节病和正常肺患者培养的成纤维细胞系以及小鼠和正常人肺成纤维细胞的博来霉素和二氧化硅诱导的纤维化模型。Chaudhary 和合著者给予 BIBF1000，一种类似于 nintedanib 的化合物，并证明该药物降低了肺组织中纤维化、TGFβ1、I 型前胶原、纤连蛋白和结缔组织生长因子 (CTGF) 的水平。此外，他们研究了 BIBF1000 对原发性肺成纤维细胞的影响，发现当通过西方分析估计时，该疗法减少了 α-SMA 的量，他们将其解释为分化为肌成纤维细胞的成纤维细胞数量减少。Wollin 等人的研究表明，尼达尼布可抑制 PDGF 诱导的 PDGF 受体 α 和 β 的磷酸化以及人肺成纤维细胞的增殖。TGFβ诱导的成纤维细胞中α-SMA基因表达降低。在小鼠肺组织中，尼达尼布降低了总肺胶原蛋白水平，以及炎症和纤维化的程度，并防止了肉芽肿的形成。最近的一项研究表明，尼达尼布可以激活成纤维细胞中的自噬途径。这些研究的结果与我们的结果一致，表明尼达尼布抑制 TGFβ 诱导的肌成纤维细胞转化、收缩和细胞侵袭，吡非尼酮和尼达尼布均可通过 TEM 和 IEM 降低单个肌成纤维细胞的超微结构特征。

　　我们的结果表明，吡非尼酮和尼达尼布的组合可能会增强抑制成纤维细胞增殖的功效。然而，没有临床研究支持这一结果。最近的初步研究评估了联合治疗的安全性和药代动力学，另一项初步研究评估了将治疗从吡非尼酮转换为尼达尼布。这两项研究都只包含少数接受这两种药物的患者，需要进一步评估，特别是因为这些药物的副作用部分重叠。

　　吡非尼酮和尼达尼布联合使用比单独使用吡非尼酮或尼达尼布更能减少基质细胞的体外增殖。两种药物都影响来自健康或 IPF 肺的培养基质细胞的胶原凝胶收缩效力、侵袭能力和肌成纤维细胞特征。我们相信基于细胞培养的体外平台未来可用于筛选新的 IPF 药物。然而，药物的作用在不同的样本中是可变的，因此需要进一步的研究来理解这种现象。

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