SIRT1可逆转索拉非尼(Sorafenib)诱导的肝细胞癌凋亡

　　索拉非尼（Sorafenib）是一种多激酶抑制剂，是晚期肝细胞癌 (HCC) 患者为数不多的全身治疗选择之一。对索拉非尼的耐药性经常发生，并且可能由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) 依赖性去乙酰化酶沉默调节蛋白 (SIRT)1 介导。我们旨在测试索拉非尼的疗效是否受细胞 NAD 水平和 NAD 依赖性 SIRT1 功能的影响。与对照组相比，我们分析了索拉非尼对过表达 SIRT1 或补充 NAD 代谢物烟酰胺单核苷酸 (NMN) 的 HCC 细胞系（HepG2、Hep3B 和 HUH7）中细胞凋亡诱导、NAD 挽救、线粒体功能和相关信号通路的影响。用索拉非尼处理 HCC 细胞系剂量依赖性地诱导细胞凋亡和细胞 NAD 浓度显着降低。SIRT1 蛋白在 HUH7 细胞中下调，但在 Hep3B 细胞中不下调。索拉非尼处理后，透化细胞中的线粒体呼吸降低，柠檬酸合酶活性减弱，细胞三磷酸腺苷（ATP）水平降低。伴随腺苷一磷酸 (AMP) 活化蛋白激酶 (AMPK) 的磷酸化增加，索拉非尼治疗导致雷帕霉素 (mTOR) 机制靶点的活性降低，表明能量剥夺。SIRT1 的瞬时过表达以及 NMN 对 NAD 的补充减少了索拉非尼诱导的细胞凋亡。因此，我们可以得出结论，索拉非尼影响 NAD/SIRT1/AMPK 轴。SIRT1 的过表达可能是 HCC 对索拉非尼治疗耐药的潜在机制。索拉非尼处理后，透化细胞中的线粒体呼吸降低，柠檬酸合酶活性减弱，细胞三磷酸腺苷（ATP）水平降低。伴随腺苷一磷酸 (AMP) 活化蛋白激酶 (AMPK) 的磷酸化增加，索拉非尼治疗导致雷帕霉素 (mTOR) 机制靶点的活性降低，表明能量剥夺。SIRT1 的瞬时过表达以及 NMN 对 NAD 的补充减少了索拉非尼诱导的细胞凋亡。

　　为数不多的晚期 HCC 全身治疗选择之一是多激酶抑制剂索拉非尼（Sorafenib），然而，它并不能在所有患者中取得治疗成功。一个原因可能是 NAD 依赖性脱乙酰酶 SIRT1 的异常表达，它调节癌症耐药性。已经表明，与非 SIRT1 过表达肿瘤的患者相比，SIRT1 过表达的 HCC 对索拉非尼的耐药性更强，生长更积极，并且患有这些肿瘤的患者预后较差。基于这些发现，我们询问 SIRT1 蛋白或活性的修饰是否会改变 HCC 细胞系中肿瘤细胞对索拉非尼的反应。

　　索拉非尼（Sorafenib）针对肿瘤发展和进展的几个中心过程。具体来说，索拉非尼能够抑制 VEGF 信号通路的酪氨酸激酶以减少肿瘤血管生成和 RAF 激酶，这与抑制 MAPK/ERK 通路导致细胞增殖减少有关。这与我们的研究一致，表明我们使用的所有细胞系都对索拉非尼治疗产生了凋亡反应。其他研究表明，索拉非尼通过 Bax 的线粒体易位和细胞色素 c 的释放诱导细胞凋亡的内在途径。这与我们的结果一致，即索拉非尼诱导线粒体功能障碍和细胞 ATP 水平降低。

　　SIRT1 使蛋白质去乙酰化并调节它们的转录或活性，从而影响细胞能量代谢以及应激反应途径。SIRT1 活性取决于 NAD 水平，因此取决于 NAMPT对 NAD 的回收。有趣的是，虽然索拉非尼（Sorafenib）孵育并未改变 NAMPT 蛋白丰度和活性，但我们研究中使用的 HCC 细胞系中 NAD 水平显着下调。我们没有发现 NAD 消耗酶聚（ADP-核糖）聚合酶 1 (PARP-1) 和 SIRT1 活性增加的证据，SIRT1 在与索拉非尼孵育后在 Hep3B 中没有改变并且在 HUH7 中降低，可能通过 p53 依赖micro-RNA-34a 的上调。有趣的是，我们发现在与索拉非尼孵育后，HUH7 细胞中 microRNA-34a 的增加。在肝细胞癌大鼠中，在索拉非尼治疗肺转移后，rno-miR-34a-5p 上调。此外，micro-RNA-34a 被证明可以使肝癌细胞对索拉非尼治疗敏感。因此，索拉非尼对 microRNA-34a 的上调可能是 HUH7 细胞中 SIRT1 下调的潜在机制。

　　我们发现，与索拉非尼（Sorafenib）孵育可降低线粒体耗氧量，这已在心肌细胞和 HCC 细胞中进行了描述。与另一项研究相比，我们发现索拉非尼对复合物 I 活性的直接抑制，以及通过索拉非尼处理的细胞中柠檬酸合酶活性降低检测到的线粒体质量的减少。与诱导线粒体功能障碍一致，索拉非尼降低了肝癌细胞中的 ATP 水平并导致细胞能量传感器 AMPK 的激活。与原代人肝细胞相比，AMPK 的磷酸化程度较低，因此在肝癌细胞系中的活性较低。活性 AMPK 抑制 mTOR 及其下游靶点 p70S6K 和 4EBP1 的磷酸化，它们分别是细胞增殖和蛋白质生物合成的重要调节剂。这与另一项研究相反，该研究表明索拉非尼（Sorafenib）不影响 AMPK 活化或 ATP 水平，这可以通过应用低得多的索拉非尼 (0.1 μM) 来解释。有趣的是，视黄酸激活 AMPK 使 HepG2 细胞对索拉非尼治疗敏感。

　　有趣的是，通过过表达增加 SIRT1 蛋白丰度或通过补充 NAMPT 的酶产物 NMN 来增强 SIRT1 活性，抵消了索拉非尼（Sorafenib）诱导的 HUH7 细胞凋亡。这与上述人类研究一致。此外，NMN 和索拉非尼的共同治疗使 NAD 水平和 AMPK 磷酸化正常化，而 mTOR 信号传导或 ERK 磷酸化不受影响。大鼠肉瘤 (RAS)/ERK 和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸 3-激酶 (PI3K)/mTOR 通路是控制细胞存活和增殖的两条主要信号通路，它们不是并行运行，而是通过交叉相互调节-抑制或激活。由于 mTOR 是来自 RAS/ERK 通路的关键信号接收器，因此可能是 RAS-ERK 通路而不是 AMPK 控制了我们细胞系统中的 mTOR 活性。同样，SIRT1 过表达并没有改善线粒体功能，这与索拉非尼（Sorafenib）对复合物 I 的直接影响一致。细胞可能通过增加糖酵解来适应复合物 I 抑制，如 SIRT1 过表达细胞和增加的 AMPK 磷酸化。

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