奥希替尼(AZD9291)降低EGFR突变的非小细胞肺癌细胞中的PD-L1

　　奥希替尼 (AZD9291) 是第三代表皮生长因子受体 (EGFR) 酪氨酸激酶抑制剂 (TKI)，已被批准用于治疗 EGFR 突变的非小细胞肺癌 (NSCLC)。在 NSCLC 患者中，EGFR 突变可能与程序性死亡配体 1 (PD-L1) 的高水平表达相关。在这里，我们发现奥希替尼在体外降低了人 EGFR 突变 NSCLC 细胞中 PD-L1 的表达.奥希替尼(125 nmol/L) 显着抑制 NCI-H1975 和 HCC827 细胞中的 PD-L1 mRNA 表达。用 N-连接糖基化抑制剂衣霉素预处理，奥希替尼 (AZD9291) 明显降低了新 PD-L1 蛋白的产生，这可能是由于 mRNA 的减少。在分别用放线菌素 D 和放线菌酮阻断转录和翻译过程后，奥希替尼继续降低 PD-L1 的表达，证明奥希替尼可能在翻译后水平降解 PD-L1，这一点通过放线菌酮追踪试验得到证实，揭示在 NCI-H1975 和 HCC827 细胞中，奥希替尼 (125 nmol/L) 将 PD-L1 的半衰期分别从大约 17.8 小时和 13.8 小时降低到 8.6 小时和 4.6 小时。用蛋白酶体抑制剂（MG-132 或硼替佐米）预处理阻止了奥希替尼诱导的 PD-L1 降解，但自噬抑制剂（氯喹）没有。此外，LiCl 对 GSK3β 的抑制阻止了奥希替尼诱导的 PD-L1 降解。结果表明，奥希替尼 (AZD9291) 降低PD-L1 mRNA表达并诱导其蛋白质降解，提示奥希替尼可能重新激活EGFR突变NSCLC患者肿瘤微环境中T细胞的免疫活性。

　　奥希替尼 (AZD9291) 是第三代EGFR-TKI，已被批准用于治疗EGFR T790M突变的非小细胞肺癌患者。与二线标准化疗相比，奥希替尼对一线 EGFR TKI 治疗后疾病进展的 EGFR T790M 阳性 NSCLC 患者表现出优异的无进展生存期和安全性特征。此外，与化疗相比，缓解持续时间、客观缓解率和疾病控制率也取得了显着改善。此外，目前正在进行一项关于奥希替尼 (AZD9291) 与吉非替尼和厄洛替尼作为 EGFR 突变 NSCLC 患者一线治疗的安全性和有效性的 III 期研究（NCT02296125）。临床研究表明 PD-L1 的高水平表达可能在 EGFR 突变 NSCLC 患者中。PD-L1 可以位于免疫细胞和肿瘤细胞的表面，并与 T 细胞受体 PD-1 相互作用，帮助肿瘤逃避免疫破坏。在这里，我们首次证明，奥希替尼抑制 EGFR 活性不仅降低了 PD-L1 mRNA 表达，而且还通过 EGFR 驱动的 NSCLC 细胞中的蛋白酶体途径导致 PD-L1 降解。

　　先前的研究表明，几种转录因子可以调节 PD-L1 的表达。Casey等人报道，MYC 直接调节人类肿瘤和小鼠肿瘤细胞中 PD-L1 mRNA 的表达。尽管奥希替尼显着降低了 MYC 表达，但敲低 MYC 并不能降低 NCI-H1975 和 HCC827 细胞中 PD-L1 mRNA 和蛋白的表达（数据未显示），这与另一项研究一致。此外，p65 参与吉非替尼诱导的 EGFR 驱动的 NSCLC 细胞中 PD-L1 mRNA 表达的降低，这与 p65 信号抑制剂支持的奥希替尼的作用不一致（数据未显示）。此外，据报道，信号转导和转录激活因子 3 (STAT3) 信号通路可调节 EGFR 突变和 ALK 阳性 NSCLC中 PD-L1 的表达.然而，我们证明奥希替尼可以抑制 HCC827 细胞中的 STAT3 信号传导，但显着的是，在 NCI-H1975 细胞中没有（数据未显示），这表明 STAT3 不是奥希替尼触发的 PD-L1 下调的关键转录因子mRNA表达。尽管我们表明奥希替尼确实降低了 PD-L1 的 mRNA 水平，但需要进一步研究参与该过程的转录因子。

　　通过抑制转录或翻译过程，奥希替尼仍能降低 PD-L1 的表达，证明奥希替尼可能诱导 PD-L1 蛋白降解。在肿瘤微环境中，肿瘤坏死因子 α 通过 p65 反式激活 COP9 信号体亚基 5 (CSN5) 诱导 PD-L1 稳定，而姜黄素对 CSN5 的抑制导致 PD-L1 泛素化和降解。Lastwika等人表明，AKT-mTOR 信号传导的抑制增加了 PD-L1 的溶酶体降解。然而，我们发现溶酶体抑制剂氯喹不能逆转 PD-L1 降解，尽管用高浓度奥希替尼治疗诱导 EGFR 驱动的 NSCLC 细胞中的自噬。不一致的是，据报道 GSK3β 介导的 PD-L1 通过泛素-蛋白酶体系统降解并且 GSK3β 失活是 PARP 抑制剂诱导的 PD-L1 上调所必需的。同样，我们的实验表明，蛋白酶体抑制剂可以逆转奥希替尼诱导的 PD-L1 降解。此外，LiCl 对 GSK3β 的失活减弱了奥希替尼诱导的 PD-L1 下调。总的来说，奥希替尼激活 GSK3β 并诱导蛋白酶体降解 PD-L1。

　　总之，我们证明了奥希替尼 (AZD9291) 对 EGFR 的灭活通过 EGFR 突变 NSCLC 细胞中的两种机制降低了 PD-L1。具体而言，奥希替尼导致 PD-L1 mRNA 表达显着下调并诱导 PD-L1 蛋白酶体降解。然而，奥希替尼调节的 PD-L1 减少在肿瘤微环境中的作用需要进一步研究。

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