他达拉非(Tadalafil)对心脏修复和改善功能的影响

　　目的是在分子水平上评估他达拉非（Tadalafil）介导的对骨髓间充质干细胞 (MSCs) 存活及其归巢至梗塞心脏以促进心脏修复和改善功能的影响。在他达拉非之前，MSCs 在体外用 PKG、MAPK、FasL、一氧化氮合酶 (NOS) (L-NAME)、CXCR4 (AMD3100) 或 miR-21 抑制剂（+/- 荧光素酶构建 +/-Fas）的抑制剂进行预处理处理 2 h。然后对这些MSCs进行H2O2应激以评估它们的损伤。对大鼠进行急性心肌梗死 (AMI)，然后注射生理盐水或 1.5 x 106间充质干细胞治疗±他达拉非进入梗死区和梗死区。在另一组中，在骨髓消融后 1 个月的大鼠中进行 AMI，并用他达拉非 ± AMD3100 或 L-NAME 腹膜内 (IP) 注射 5 天。此外，在另一组中，AMI 小鼠在静脉注射111 个In-oxine-MSCs之前用 IP ± 他达拉非治疗，然后进行 CT/SPECT 成像以定位动员的 MSCs。通过超声心动图评估心脏功能。通过分子生物测定法分析 MSCs 和心脏提取物。他达拉非（Tadalafil）处理的 MSCs 具有更高的 cGMP、NOS、SDF-1 表达α表达、p-VASP、p-Erk1/2、p-STAT3、p-Akt、PKG1 和 Bcl-xl；PKG1、MAPK、NOS 或 FasL 抑制剂降低了这些分子的表达。他达拉非通过增加 miR-21 表达来抑制细胞凋亡，并通过抑制 Fas（由 PKG1、MAPK 或 miR-21 抑制剂恢复）来提高细胞存活率。在体内，他达拉非治疗的 AMI 动物与对照组相比，心脏功能、移植细胞存活、MSCs 动员和归巢得到改善。结论：他达拉非通过上调 miR-21 依赖性抑制 Fas 来延长 MSCs 的存活率，并增加 MSCs 的动员和它们归巢到梗塞心肌中，从而改善心脏修复和功能。

　　目前的移植策略仅实现了供体干细胞在梗塞心肌中的最小持久移植，这主要是由于供体干细胞的寿命相当短。

　　在这项研究中，他达拉非（Tadalafil）治疗的细胞保护作用增加了 MSCs 的存活率，总-Akt、p-Akt、Bcl-xl、Bcl2、cGMP、p-Erk1/2、p-VASP、p-GSK3β、PKG1、 NO、SDF-1α、iNOS 和 p-STAT3；和较低的 Fas 表达。通过 L-NAME 预处理和 AMD3100 预处理降低了体外 MSCs 的这种细胞保护作用。他达拉非治疗后 p-Erk1/2 和 p-STAT3 活性的显着增加被 PKG1 或 MAPK 抑制剂预处理消除。PKG1 和 MAPK 抑制剂可显着恢复他达拉非减轻的 Fas 蛋白，这与之前的研究一致。PKG1 下游的 VASP 可能参与细胞内信号通路。此外，p-Erk1/2 和 p-STAT3 的激活参与了预处理诱导的 PKG1 表达，以及它对 Fas 通路的下游影响，这与之前的研究一致。

　　我们的研究结果表明，Fas 在细胞凋亡中起关键作用，被认为是 miR-21 通过 MAPK 信号通路的靶点之一。用他达拉非预处理 MSC 通过上调 miR-21 显着提高其存活率，而 miR-21 在 PKG1-MAPK 和 miR-21 抑制剂存在下降低。此外，我们观察到 miR-21 与他达拉非的表达通过直接靶向 Fas 的 3'-UTR 来促进 MSCs 的存活。这些结果表明 PKG1/MAPK 信号通路在 miR-21 调节中起作用。这一结论与先前的研究一致，表明 miR-21 在抗细胞凋亡中起关键作用，并且可以通过刺激 MAPK 信号传导负调节 Fas 基因。STAT3 也被 Tyr705 的磷酸化激活，转录激活似乎是通过 MAPK 通路由 STAT3 在 Ser727 的磷酸化调节的。这些数据与我们之前在二氮嗪预处理骨骼成肌细胞中的研究结果一致，其中 miR-21 被确定为通过白介素-11 诱导的 Erk1/2-STAT3 信号传导发挥作用的关键抗凋亡调节剂。在另一项研究中，Fas 被确定为 miR-146a 的一个重要靶基因，并且这种靶向与观察到的 NF-kB 介导的对 BM 衍生干细胞的抗凋亡作用有关。这一结论也与另一项研究一致，该研究确定了 Akt 的独特参与，即它通过 miR-21 依赖性抑制 FasL 来抑制细胞凋亡。因此，miR-21 似乎通过调节保护或损伤相关基因如抑制第十号染色体缺失的 FasL、磷酸酶和张力蛋白同源物 (PTEN) 在他达拉非诱导的心脏缺血损伤和细胞凋亡保护中发挥重要作用, 原肌球蛋白 1, 程序性细胞死亡 4 (PDCD4), p53 家族的 TAp63 同工型, sprouty 1 和 2, 异质核核糖核蛋白 K 和 LRRFIP1 (NF-kB 抑制剂)。

　　我们的研究首次报道了他达拉非（Tadalafil）对 AMI 中 MSC 动员和归巢的有益作用。静脉注射111 个In-oxine 标记的 MSCs 后，大多数 MSCs 在第一次通过时最初被困在肺毛细血管内。在接下来的 48 小时内，很大一部分标记的 MSC 从肺毛细血管系统逃逸并迁移到他达拉非治疗的梗塞心脏（17.5%），而对照组（3.6%）。然而，我们不能排除111In-oxine 对 MSCs 功能和活力的潜在负面影响。96 小时后心脏中有限的细胞积累与另一项研究报告的结果一致，其中111一旦标记的 MSCs 被困在肺毛细血管中，就可能发生从标记细胞泄漏或被网状内皮细胞吞噬的标记细胞。尽管如此，111 个In-oxine 标记的供体干细胞已被用于在动物和人类的细胞移植后长达 10 天的随访或监测移植细胞进入缺血组织的命运。111In-oxine-造血祖细胞（冠状动脉内注射）在梗塞心脏中被调动高达 2.3 倍（比活性）。另一个，嫁接99Tc 标记的胎儿心肌细胞（IV 注射）分化成心血管谱系的所有主要细胞，并通过生长因子对心脏重塑的旁分泌作用促进心脏再生。111In-oxine 是安全的，临床上可用于标记干细胞，作为磁共振染料、传统基因报告基因（β-gal 或碱性磷酸酶）或荧光染料的替代品。

　　总之，他达拉非（Tadalafil）治疗通过 PKG-MAPK 信号通路上调 miR-21 依赖性 Fas 抑制增加离体 MSCs 存活。他达拉非还通过 NO/cGMP、PKG1/MAPK 和 SDF-1α/CXCR4 级联提高了移植的 MSCs 在体内的存活率并促进了 MSCs 向缺血性心脏的动员和归巢。用111In-oxine标记干细胞为连续监测细胞运输、分布和评估推定的治疗药物的归巢效应提供了一种有效的方法。微信扫描下方二维码了解更多：