瑞格非尼/瑞戈非尼的潜在分子逃逸机制

　　瑞戈非尼/瑞格非尼提高了难治性转移性结直肠癌 (mCRC) 患者的生存率，但遗传性或获得性耐药的机制尚不清楚。共招募了 50 名难治性 mCRC 患者。循环肿瘤细胞 (CTC) 计数在基线、瑞戈非尼/瑞格非尼开始后第 21 天和疾病进展时 (PD) 使用 CellSearch 系统 (Veridex LLC, NJ, USA) 进行。从 CTC 中提取 Poly(A) mRNA，并通过基于多重 PCR 的 DNA 芯片分析上皮和上皮间质转化标志物的基因表达。在基线和第 21 天时，CTC 少于 3 的患者的无进展生存期比 3 或更多 CTC 的患者更长（3.3 vs 2.0 个月，P =.008 和 3.3 vs 2.0 个月，P =.004，分别）。在基线和第 21 天时，CTC 少于 3 的患者的总生存期 (OS) 长于 3 或更多 CTC 的患者（分别为 10.0 与 4.6 个月，P <.001 和 8.7 与 3.8 个月，P =.003）。在多变量分析中，CTC 计数在基线和第 21 天仍与 OS 显着相关（P= .019 和P= .028）。64% 的患者在第 21 天和/或 PD 时循环肿瘤细胞EGFR基因表达上调。与基线相比，患者在 PD 时的EGFR表达显着增加（P =.041）和在第 21 天和/或 PD 时与基线相比（P =.004）。我们的研究结果表明，CTC 计数和EGFR表达可能是瑞格非尼疗效和结果的有用标志物。CTCEGFR表达的上调可能是瑞戈非尼治疗下的一种分子逃逸机制。

　　我们的研究首次表明 CTC 计数和 mRNA 基因表达水平可能是 mCRC 患者中瑞戈非尼/瑞格非尼疗效的有用标志物。具体来说，我们发现在基线和第 21 天存在 3 个或更多 CTC 是较差生存率的独立预后因素。此外，瑞戈非尼诱导的 CTCEGFR表达上调与疾病进展有关。

　　瑞戈非尼/瑞格非尼阻断 WT 和突变型BRAF(V600E) 信号传导。先前的临床前研究表明，抑制BRAF会导致 EGFR 信号的反馈激活并增加EGFR表达，从而允许持续的肿瘤细胞增殖。在以前的研究中，肿瘤组织EGFR表达已被证明是一种阴性预后标志物。15我们的数据进一步支持了这些发现，表明瑞戈非尼治疗可以增加EGFR表达和信号传导至一定程度，从而导致分子逃逸和治疗耐药。基线 CTC 患者基线 CTC EGFR0.05 或更高水平的 PFS 更短，并且在首次放射影像学评估时出现疾病进展。尽管本研究的结果产生了假设，但如果在未来的研究中得到验证，CTCEGFR表达可以作为一个有用的标志物，在开始治疗之前识别对瑞戈非尼/瑞格非尼耐药的患者。

　　重要的是，我们调查了具有和不具有可检测 CTC 的患者的 CTC 基因表达水平，如 CellSearch 测定所定义的那样。根据 CellSearch 标准，未检测到 CTC 的患者亚组具有上皮标记基因的表达，表明存在循环肿瘤负荷、CTC 或细胞碎片（如外泌体），这些都未被 CellSearch 系统检测或识别。同样，在 Mostert 等人的一项研究中，发现没有可检测到 CTC 的 CRC 患者具有循环肿瘤 mRNA 谱，与具有 3 个或更多可检测 CTC 的患者和健康供体不同，这进一步表明 CellSearch 未检测到 CTC 的患者的血液可能含有 CTC 或片段。在通过 CellSearch 标准未检测到 CTC 的患者中，外泌体仍可能存在，因为 CTC 分离之前是基于 Ficoll 的密度梯度富集。综上所述，我们的研究结果强调了仅依赖 CTC 计数作为生物标志物的局限性，以及循环 mRNA 表达作为瑞戈非尼/瑞格非尼治疗的 mCRC 患者潜在预后标志物的重要性。

　　此外，我们研究中相当大比例的患者在基线或随后的随访中没有可检测到的 CTC。先前的报告表明，CRC 细胞可能缺乏 CK8、18 或 19 表达，这是 CellSearch 中定义 CTC 的标志物，反映了这些细胞的 EMT 样表型。CK8、18 或 19 表达的缺乏不会影响通过免疫磁性富集分离 CTC，这是基于它们的 EpCAM 表达。然而，缺乏细胞角蛋白表达可能导致这些细胞未被鉴定为上皮细胞，因此在随后的计数步骤中不被计为 CTC。因此，除了存在细胞碎片（例如外泌体）之外，根据 CellSearch 标准缺乏可检测 CTC 的另一个可能解释可能是上皮标志物（即 CK8、18 和 19）的表达不足。

　　据报道，CTC 通常以 EMT 状态存在或可以共表达上皮和间充质标志物。在 EMT 期间，上皮细胞下调上皮相关基因，获得间充质基因表达，并在其细胞骨架中发生重大变化，导致细胞间接触和细胞极性丧失，从而导致运动性和侵袭性增加。在这里，我们研究了 CTC EMT 标志物的表达，包括TWIST1、Akt2和PI3Kα，以及 CTC 之间的关联EGFR之间的关联和 EMT 基因表达，并发现反向关联的趋势不显着。缺乏显着关联可能反映了与使用 CellSearch 技术表征 CTC 相关的挑战，包括在富含 CTC 的血液组分中存在过量的表达 EMT 标记基因的白细胞。

　　总之，我们将 CTC 计数确定为接受瑞戈非尼/瑞格非尼治疗的 mCRC 患者的预后标志物。在疾病进展时，使用瑞格非尼显着增加循环肿瘤细胞EGFR表达，这表明这是一种耐药模式，并为瑞格非尼和抗 EGFR mAb 所见的协同效应提供了进一步的机制证据。20我们的研究结果值得进一步研究，如果在未来的研究中得到复制，可以为选择最适合在化学难治性环境中使用瑞戈非尼/瑞格非尼的 mCRC 患者提供信息。

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