外排转运蛋白对普纳替尼(ponatinib)穿过BBB的速率和程度的影响

　　实施了描述药物通过 BBB 转运的隔室血脑屏障 (BBB) 模型，以评估外排转运蛋白对多激酶抑制剂普纳替尼（ponatinib）穿过 BBB 的速率和程度的影响。野生型和转运蛋白敲除小鼠的体内药代动力学研究表明，两种主要的 BBB 流出转运蛋白 P-糖蛋白 (P-gp) 和乳腺癌抗性蛋白 (Bcrp) 协同调节普纳替尼的脑暴露。在缺乏 P-gp 和 Bcrp [ Mdr1a/b(-/-)Bcrp1(-/-)的三重敲除小鼠中，总和未结合（游离）脑与血浆的比率大约高 15 倍] 与野生型小鼠相比。与单敲除小鼠 [ Bcrp1(-/-)或Mdr1a/b(-/-)]相比，三敲除小鼠对普纳替尼的脑暴露量的增加大于附加增加，表明转运蛋白介导的药物流出的功能补偿.基于表征观察到的大脑和血浆浓度-时间曲线的 BBB 模型，与Mdr1a/b(-/-)Bcrp1( -/-)在没有外排转运蛋白（P-gp 和 Bcrp）的情况下，小鼠的平均转运时间（普纳替尼在单次通道中在大脑中花费的平均时间）显着增加。这项研究表征了转运蛋白介导的药物从大脑流出，这一过程减少了大脑中普纳替尼暴露的持续时间和程度，并且对使用靶向药物递送治疗脑肿瘤具有重要意义。

　　先前已经报道了 BBB 流出转运蛋白的功能协同药物转运对几种酪氨酸激酶抑制剂具有重要意义，这种限制性脑递送对疗效产生负面影响。与我们最近的出版物一致，该出版物报道了普纳替尼（ponatinib）在 PDX GBM 模型中的原位疗效受限，本研究显示了 BBB 处转运蛋白介导的药物流出，这支持了其对普纳替尼向大脑的自由药物递送受损的贡献。与缺乏单一转运蛋白相比，由于缺乏 P-gp 和 Bcrp 转运蛋白活性而导致的 DA 更大。这表明普纳替尼是 P-gp 和 Bcrp 的双重底物，这两种转运蛋白在功能上协同作用以限制普纳替尼的脑分布。消除这些外排转运蛋白的看门人功能降低了组织转移速率常数（即 kout）和普纳替尼从大脑中的清除率（即 CLout和 CLu,out)，导致外排缺陷小鼠的脑组织暴露量（AUC脑）以及更大的 MTT 或治疗暴露时间。

　　四种基因型（即脑排出率常数和脑外清除率）之间普纳替尼转运出脑的差异幅度可以通过Kp 和Kp,uu 估计值来描述。然而，基于总药物的 CL 和 Kp 估计值可能会产生误导，因为这没有考虑游离（活性）药物浓度。正如普纳替尼所见，接近统一的 Kp 值并不总是表明血浆中的药物有效地穿过 BBB，因为 Kp 值可能会被血浆和大脑之间药物结合亲和力的相对大小混淆。相反，只有游离药物可以穿过 BBB，因此 BBB 渗透的评估需要使用反映游离药物运动的参数，包括 Kp、uu 和 V你，大脑。这些结果与之前的出版物的结果一致，该出版物报道了由于异质组织结合和药物分布到颅内肿瘤中，ponatinib 在 GBM 的 PDX 中的功效受损。Kp 和 Kp,uu 之间的这种差异突出了考虑血浆和脑中的相对药物结合的重要性，因为高 Kp 值（即，接近 1）可能会歪曲活性化合物的脑递送程度，因此可能无法准确预测递送有效的药物浓度。脑匀浆中游离部分与血浆中游离部分的比值与 DA相匹配，这与之前的报告的结果一致，该报告评估了这种相关性以预测 CNS 渗透的程度研究化合物。如果不存在所有转运蛋白介导的外排并且清除进入和出脑者等价。然而，在Mdr1a/b(-/-)Bcrp1(-/-)中观察到的 Kp,uu 值略大于 1，范围从 1.1 到 1.7老鼠。虽然实验错误也可能导致 Kp,uu 大于 1，但将普纳替尼转运到大脑的弱流入系统的存在也可能导致这一结果。鉴于三重敲除小鼠中的这种 Kp,uu，ponatinib 关于可能的 BBB 摄取转运蛋白的底物状态是令人感兴趣的。这些转运蛋白可能包括各种有机阴离子，尤其是阳离子转运系统，以及营养物质流入转运系统，例如氨基酸流入系统。众所周知，流入系统可以影响游离药物在 BBB 上的分配程度。有必要进一步研究这种流入机制，以确定普纳替尼的这种可能的少量流入成分是否会影响荷瘤大脑中的最终疗效。

　　转运蛋白敲除小鼠的使用有助于阐明 BBB 中功能性协同转运蛋白介导的药物流出，用于研究化合物。三重敲除小鼠 [Mdr1a/b(-/-)Bcrp1(-/-)] 的 Kp 值在缺少 Bcrp 或 P-gp 的单个敲除小鼠中的 Kp 增加大于加性增加，无论路线如何管理和分析方法（即 NCA 和分区分析）。这表明缺乏一种外排转运蛋白会导致另一外排转运蛋白对普纳替尼进行功能补偿，如先前文献中对许多化合物的描述。血脑屏障外排转运蛋白的这种功能合作并不伴随着四种基因型——野生型、Bcrp1(-/-)、Mdr1a/b(-/ -)的分离脑毛细血管中P-gp和Bcrp表达的补偿性变化。)和Mdr1a/b(−/−)Bcrp1(−/−) —根据之前的定量蛋白质组学研究。这项蛋白质组学研究还报告说，从野生型、 Bcrp1(-/-)和Mdr1a分离的脑毛细血管内皮细胞中，P-gp (Mdr1a/b) 的定量表达水平比 Bcrp 高约 4.6 倍/b(−/−)Bcrp1(−/−)老鼠。因此，P-gp 的基因缺失将导致比 Bcrp 更高的脑血浆比（Kp 或 Kp,uu），尤其是当这些外排转运蛋白的药物转运能力（相对表达水平），而不是在相对亲和力（对 P-gp 与 Bcrp 的结合亲和力）决定了转运蛋白介导的流出。在本研究中，与 Bcrp [Bcrp1(-/-) ] 相比，在没有 P-gp [ Mdr1a/b(-/-)]的情况下，普纳替尼具有更高的脑血浆比。这表明，与 P-gp 和 Bcrp 的协同流出有关的功能能力驱动了转运蛋白介导的普纳替尼在 BBB 的流出。

　　总之，这项研究表明，两种主要的外排转运蛋白 P-gp 和 Bcrp 协同调节普纳替尼（ponatinib）的脑暴露，而不影响对普纳替尼的全身暴露。缺乏 P-gp 和 Bcrp 的转基因小鼠的脑浆比高于单一敲除基因型 [Mdr1a/b(-/-)中脑浆比的预期值或Bcrp1( -/-)]，表明普纳替尼在功能上协同转运出大脑。隔室分析和 NCA 得出了描述脑穿透程度的类似参数估计，并且隔室 BBB 模型很好地描述了观察到的数据（血浆和脑浓度-时间曲线），从而提供了对普纳替尼在 BBB 中转运的深入了解。转运蛋白介导的 BBB 外排转运降低了普纳替尼的脑渗透程度（Kp 和 Kp,uu），这种转运机制进一步损害了 MTT大脑的治疗暴露时间价值。Ponatinib 脑分布是一个典型案例，可以了解药物结合如何影响疗效以及总 Kp 可能如何误导。结合之前关于颅内肿瘤异质结合和药物分布的数据，转运蛋白介导的普纳替尼在 BBB 外排进一步损害了其治疗 GBM 的治疗潜力。

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