米哚妥林(midostaurin)在肺癌中的活性

　　肺癌与高患病率和死亡率相关，尽管靶向药物在基因组定义的肺癌亚群和免疫治疗中取得了重大成功，但大多数患者目前并未从这些治疗中受益。通过靶向药物筛选，我们发现最近批准的多激酶抑制剂米哚妥林（midostaurin）在几个肺癌细胞中具有有效的活性，与其预期的靶点、PKC 或特定的基因组标记无关。为了确定潜在的作用机制，我们应用了分层功能蛋白质组学方法和新的数据集成方法。使用化学蛋白质组学，我们在这些细胞中鉴定了多个米哚妥林激酶靶标。使用来自 STRING 数据库的蛋白质-蛋白质相互作用将这些目标与定量酪氨酸和全球磷酸蛋白质组学数据进行基于网络的整合，表明多个目标与 midostaurin 的作用方式相关。随后使用 RNA 干扰和选择性小分子探针进行的功能验证表明，需要同时抑制 TBK1、PDPK1 和 AURKA 才能引发 midostaurin 的细胞效应。下游信号节点的免疫印迹分析表明，这些靶点的联合抑制改变了 PI3K/AKT 和部分收敛于 PLK1 的细胞周期信号通路。此外，米哚妥林（midostaurin）与强效 PLK1 抑制剂 BI2536 的合理组合引发了强烈的协同作用。我们的结果表明，互补的功能蛋白质组学方法和随后的基于网络的数据集成相结合，可以揭示对多激酶抑制剂的复杂作用模式、药物发现的可操作靶点和癌症脆弱性的新见解。

　　尽管基因组学取得了巨大进步，精准医疗也取得了相关成功，但大多数癌症，包括许多 NSCLC 肿瘤，目前并未表现出可操作的突变，因此迫切需要新的抗癌靶点。以 FDA 批准的多激酶抑制剂米哚妥林在 NSCLC 细胞中的无法解释的细胞活性为指导，我们应用了一种综合的功能蛋白质组学方法，包括化学蛋白质组学以及全局和酪氨酸磷酸蛋白质组学。通过阐明 midostaurin 的全网络信号效应和复杂的 MoA，该策略导致了肺癌新的可操作靶点的鉴定。重要的是，与其他强效和选择性抑制剂相比，midostaurin 在这些细胞中的活性与其经典靶点 PKC 和 FLT3 无关。此外，我们发现米哚妥林（midostaurin）的 MoA 依赖于同时抑制至少三个不同的非规范目标。这一观察不仅构成了一个罕见且有趣的多重药理学案例，但也有力地证明了应用无偏见的多层蛋白质组学方法和基于网络的分析来捕捉底层机制的复杂性的必要性。这种策略特别重要，因为这些细胞中的相关米哚妥林（midostaurin）靶标没有发生突变，因此对大多数基因组学方法“隐藏”，而且它们的贡献是基于它们在信号网络中的广泛影响。我们的研究结果进一步说明了将这些正交蛋白质组学技术相结合的力量，因为化学蛋白质组学和磷酸蛋白质组学分析都不会轻易地提出这种广泛的功能相关靶点和途径。

　　整合化学和磷酸蛋白质组学数据集，深入挖掘由此产生的米哚妥林（midostaurin）效应网络和随后的功能验证，突出了三种激酶作为这些 NSCLC 细胞中相关的米哚妥林靶标，即 AURKA、PDPK1 和 TBK1。TBK1 是一种 IκB 激酶 ε (IKKε) 的密切同源物，最初被鉴定为在先天免疫反应中起作用，在这种情况下特别令人感兴趣，因为它最近被描述为在几种 NSCLC 中与突变KRAS具有综合致死性细胞系。值得注意的是，尽管这一发现已针对几种细胞系进行了独立验证，但后来对更广泛的 NSCLC 细胞系组的研究报告了KRAS的一系列敏感性-对 TBK1 沉默/抑制的突变 NSCLC 细胞系。这与我们的观察结果一致，即 TBK1 抑制仅导致这些特定 NSCLC 细胞系的活力部分降低。米哚妥林还在几种KRAS-wt 细胞中显示出活性，相反，它不影响许多其他KRAS-突变 NSCLC 细胞，包括一些对TBK1丢失敏感的细胞，例如 H23 细胞。这进一步说明了多靶点机制的重要性，因为米哚妥林在 NSCLC 细胞中的细胞活性不能简单地还原为KRAS突变细胞中单独的 TBK1 抑制。TBK1 已显示在 T308 和 S473 磷酸化 AKT，这与我们在 A427 细胞中的观察结果一致，尽管 BX795 对 TBK1 的抑制对 T308 的影响较小。然而，抑制 PDPK1（另一个重要的米哚妥林靶标）也显着降低了 T308 处的 AKT 磷酸化，并进一步降低了 S473 的下游，正如预期的这种 PI3K-AKT 信号级联的典型激活剂。一致地，米哚妥林处理引起了对 T308 磷酸化的类似抑制。然而，米哚妥林并未降低 S473 磷酸化，表明 mTOR 反馈信号和/或抑制在此阶段挽救效果的另一个目标。此外，我们观察到 CAMKK2 介导的 AMPK 磷酸化受到显着抑制，AMPK 是一种已知的肿瘤抑制因子和 mTOR 信号传导的负调节因子。虽然 AMPK 作为 mTOR 复合物 1 (mTORC1) 的一部分调节 mTOR，并且 AKT S473 是 mTORC2 的靶位点，但最近表明 AMPK 激活也可以降低 NSCLC 细胞中的 mTORC2 活性和 AKT S473 磷酸化。有趣的是，最近的研究发现，抑制 AURKA 可以克服胃肠道癌细胞对 mTOR 抑制剂的耐药性，并且 AURKA 可以抑制 NSCLC 细胞中的 STK11(LKB1)/AMPK 信号传导。这些数据与我们的发现一致，即 AURKA 抑制是米哚妥林的 MoA 的主要成分，在STK11野生型细胞中可能更是如此。此外，我们观察到对其他重要的 AURKA 下游信号的显着影响，即组蛋白 H3 S10 和 PLK1 T210 的磷酸化。与先前关于 PLK1 的报道一致，这些信号还因 TBK1 抑制而降低，尽管强度较弱。虽然 PLK1 T210 也被认为是 PDPK1 的底物，我们在 A427 细胞中没有发现这方面的证据，这表明米哚妥林对 PDPK1 的抑制可能通过其他下游靶标对这些细胞中的整体 MoA 起作用。正如其他地方详细回顾的那样，PLK1 和 AURKA 已经很好地建立了在有丝分裂和细胞分裂过程中参与多种功能相互作用。此外，它们在控制 G2/M 细胞周期检查点和有丝分裂进入 中发挥关键作用，这与米哚妥林处理后 G2 细胞的强烈积累非常吻合。有趣的是，最近有报道称 TBK1 也影响有丝分裂。

　　总之，通过结合使用无偏的、分层的功能蛋白质组学和基于网络的数据集成，我们能够阐明多激酶抑制剂米哚妥林（midostaurin）在肺癌细胞中的作用机制，这与其同源靶标无关，而是涉及几个非规范的米哚妥林目标。对下游信号效应的分析确定了特定致癌途径的收敛性，这导致了一种新型协同药物组合的合理设计。这种综合蛋白质组学方法的成功应用说明了它有可能回答复杂的生物学问题并揭示基因组学方法可能不明显的新的可操作的癌症脆弱性。微信扫描下方二维码了解更多：