BRCA1的过表达减弱了易瑞沙/吉非替尼引起的DNA损伤

　　易瑞沙/吉非替尼是一种口服活性抗肿瘤剂，通过阻断表皮生长因子受体 (EGFR) 信号通路来抑制不受控制的细胞增殖。各种体外和体内研究表明，乳腺癌易感基因 1 (BRCA1) 的表达上调与化疗耐药和化疗后生存率降低有关。在本研究中，使用吉非替尼高敏感性细胞系 PC-9 来研究 BRCA1 表达对 PC-9 细胞对吉非替尼敏感性的影响。PC-9 细胞被 BRCA-1 (HA-tagged) 稳定转染。用吉非替尼处理转染和未转染的PC-9细胞，通过蛋白质印迹检查磷酸化的γH2AX以确定DNA损伤。吉非替尼治疗后，PC-9 细胞增殖抑制，PC-9-pcDNA3。1细胞和BRCA1转染的PC-9细胞进行了测定。此外，还进行了彗星试验以确定吉非替尼引起的 DNA 损伤。吉夫替尼治疗 6 小时、12 小时和 24 小时显着增加了磷酸化 γH2AX 的细胞表达。在吉非替尼治疗下，BRCA-1过表达的PC-9细胞对增殖的抑制作用明显低于未转染的PC-9细胞，表明BRCA1的过表达在减弱PC-9的敏感性中起作用细胞到吉非替尼。彗星试验显示，BRCA1转染的细胞显示出较短的彗尾，表明BRCA1的过表达减弱了吉非替尼引起的DNA损伤。BRCA1的过表达减少了DNA损伤，增强了DNA修复机制。

　　据报道，肺癌是癌症相关死亡的主要原因，2012 年有 159 万人死亡。作为肺癌的一种，NSCLC 占所有肺癌病例的 80% 以上，预后较差，生存期较差。已在各种癌症类型中检测到 EGFR 的激活和过表达，并建议其促进肿瘤发生、癌症进展和转移。因此，EGFR是癌症治疗的重要靶点之一，包括阻断EGFR活化的小分子TKI易瑞沙/吉非替尼。研究表明，吉非替尼治疗降低了 pEGFR、pAKT 和 pERK 的水平，其中涉及 DNA 合成和 DNA 修复。由 EGFR 介导的 DNA 修复机制显示需要与 DNA 蛋白激酶 (DNA-PKcs) 的催化亚基结合，这些亚基与 EGFR 形成复合物，调节非同源末端连接以修复 DNA 链断裂。吉非替尼治疗可以抑制 EGFR 的激活，并阻断 DNA-PKcs 和 EGFR 之间的相互作用。

　　pγH2AX 的存在表明 DNA 损伤，包括双链断裂和单链损伤。DNA 损伤可能是由外源性因素（如辐射）或内源性因素（如致癌突变和正常的 DNA 复制）引起的。对 A549 和 H1299 细胞的研究表明，抗癌药物易瑞沙/吉非替尼治疗会干扰 DNA 修复机制，因此会延长 DSBs 的存在，从而诱导 pγH2AX 的积累。我们的研究还证实了在 PC-9 细胞中响应吉非替尼的 pγH2AX 细胞水平增加。尽管我们研究中的 PC-9 细胞没有暴露于辐射以产生 DNA 损伤，但我们模型中 DNA 损伤的主要来源是正常的 DNA 复制。积累的 pγH2AX 对于招募参与 DNA 修复的各种复合物（包括 BRCA1）至关重要。

　　作为DNA修复的重要机制，同源重组（HR）需要BRCA1调控转录，激活细胞周期检查点，从而修复DNA损伤。BRCA1 在 DNA 修复中的重要作用涉及 BRCA1 与各种细胞蛋白之间的相互作用，例如 BARD1、PALB 和 RAD51。在我们的研究中，我们检测到 pRAD51 的细胞水平增加，以响应由易瑞沙/吉非替尼引起的 DNA 损伤。Scully 等人在核病灶中检测到 BRCA1 和 RAD51 的共定位。BRCA1 不是 BRCA1 和 RAD51 之间的直接相互作用，而是招募 BRCA2，这有助于将 RAD51 加载到 DNA 损伤位点。在这个复合物中，BRCA1 在识别 DSB 位点中发挥作用，因为 BRCA1 的敲低显示减少了 DNA 链上 RAD51 病灶的形成。该复合物的一个重要结构域是 BRCA1 的卷曲螺旋结构域。卷曲螺旋结构域的错义突变已被证明会破坏 BRCA1 和 PALB2 之间的相互作用，从而降低 HR 功效 。BRCA1识别DNA损伤位点后，募集的RAD51是直接促进DNA修复的蛋白质。Hela 细胞中 RAD51C 的消耗揭示了较低的核 RAD51 水平，表明除了 BRCA2 的参与外，RAD51C 是促进 RAD51 进入细胞核的另一种重要蛋白质。因此，在本研究中，BRCA1 的过表达显着增加了 pRAD51，并对吉非替尼有早期反应。然而，在 BRCA1 过表达的 PC-9 细胞中，吉非替尼治疗 12 小时后 pRAD51 的细胞水平开始降低。这可能是由于那些促进 RAD51 进入细胞核的蛋白质的活性降低，导致 DNA 修复减少。这也解释了在 BRCA1 过表达的 PC-9 细胞中，吉非替尼处理 12 小时后 pγH2AX 增加，以及吉非替尼处理 24 小时后细胞生长抑制增加。尽管介导了 RAD51 对 DNA 链侵袭的活性，但 BRCA1 还可以与其他蛋白质相互作用，包括用于 S 期检查点的 BACH1 和用于泛素化染色质靶向的 Rap80，这也起到调节细胞增殖的作用。

　　BRCA1 在 DNA 修复以及细胞周期调节中的作用已在各种癌症类型中进行了研究。在来自乳腺癌和卵巢癌的细胞系中，BRCA1 的敲低促进了恶性细胞的生长，而将 BRCA1 引入细胞中可抑制肿瘤细胞的增殖 。这些结果表明 BRCA1 在乳腺癌和卵巢癌中的生长抑制活性。然而，BRCA1 在 NSCLC 中表现出相反的作用。在我们的研究中，BRCA1 的过表达减弱了易瑞沙/吉非替尼诱导的细胞生长抑制，尽管随着吉非替尼暴露的延长，细胞生长抑制增加。

　　据报道，44%的NSCLC表现出BRCA1 mRNA和BRCA1蛋白表达降低。此外，一项针对 BRCA1 缺陷型 NSCLC 亚组的研究揭示了奥拉帕尼的有效治疗方法，该药物通过靶向多聚（ADP-核糖）聚合酶 (PARP) 抑制 NSCLC 的进展。奥拉帕尼的一项 IB 期研究指出，具有高表达水平 BRCA1 的 EGFR 突变患者在使用 TKI（如吉非替尼）治疗时表现出较短的无进展生存期。这表明过表达的 BRCA1 降低了 TKI 治疗的有效性，这与我们的研究结果一致。我们的研究表明，BRCA1 的过表达显着降低了 DNA 损伤，并减弱了吉非替尼诱导的细胞生长抑制。

　　在 PC-9 细胞系中评估了易瑞沙/吉非替尼对细胞生长抑制和 DNA 损伤的影响。吉非替尼治疗诱导的 DNA 损伤以及细胞生长抑制因 BRCA1 的过表达而显着减弱，尽管减弱不会延长超过 24 小时。我们的研究结果揭示了 BRCA1 在响应抗癌 TKI 药物的 NSCLC 细胞存活中的重要作用。因此，我们认为 BRCA1 可以作为药物开发的靶点。微信扫描下方二维码了解更多：