阿法替尼afatinib可以抑制GBM细胞中的EGFR活化情况

　　我们通过免疫印迹检查了阿法替尼（afatinib）单独或与 TMZ（替莫唑胺）联合对 EGFR 活化的影响。阿法替尼治疗显着抑制 U87MG、U87EGFR WT、U87EGFRvIII 和 U87EGFRvIII DK 中的 EGFR 活化（磷酸化 EGFR），而 TMZ 没有效果。有趣的是，我们观察到在 EGFRvIII 细胞中，阿法替尼比厄洛替尼（第一代 EGFR 抑制剂）抑制 pEGFR 的时间更长且更有效。阿法替尼和厄洛替尼对总 EGFR 没有影响。阿法替尼对 GBM（胶质母细胞瘤）细胞系 U251 和 U251EGFRvIII 中的 EGFR 活化具有相似的抑制作用。

　　GBM 具有局部侵袭性并侵入血管周围区域。我们分析了阿法替尼和TMZ对U87MG和U87EGFRvIII GBM细胞迁移和侵袭的影响。与 U87 细胞相比，阿法替尼单独或与 TMZ 联合使用显着降低了 U87EGFRvIII 细胞的迁移。单独使用阿法替尼对 U87MG 细胞没有显着影响。TMZ组（ p= 0.02）和联合组（p= 0.001）组U87MG迁移细胞数量显着减少；TMZ 与 TMZ 加阿法替尼 (p= 0.04))。同样，TMZ 和联合治疗显着降低了 U87EGFRvIII 的迁移（对照与任何治疗（p = 0.02）；TMZ 与 TMZ 加阿法替尼（p = 0.02））。与对照相比， TMZ (p= 0.03) 和联合治疗 (p = 0.02) 显着减少了侵袭性 U87MG 细胞的数量。与对照相比，处理细胞中侵袭性 U87EGFRvIII 细胞的数量显着减少 [TMZ (p= 0.005)；阿法替尼 (p= 0.01)]；组合（p= 0.0002））。此外，在 U87MG 和 U87EGFRvIII 中，与单独使用 TMZ 相比，联合治疗显着减少了侵袭细胞的数量 [U87MG (p = 0.001)；U87EGFRvIII (p = 0.03)]。

　　癌症干细胞对 CRT 具有高度抗性，并且在肿瘤复发中起主要作用。与 U87MG 细胞相比，我们观察到 U87EGFRvIII 细胞中 CSC 的比例显着更高（p= 0.03）。而阿法替尼显着降低了 U87MG 和 U87EGFRvIII 细胞中 CSC 的百分比（p= 0.02）。TMZ 仅减少 U87MG 细胞中的 CSCs, 。在对照组、TMZ、阿法替尼和联合组中，U87EGFRvIII GBM 细胞中 CSC 的平均百分比分别为 1.03 ± 0.2、1.0 ± 0.2、0.13 ± 0.05 和 0.2 ± 0。

　　我们使用体外克隆形成（神经球）测定进一步验证了我们的结果。我们观察到由 U87EGFRvIII CSCs 细胞 (29 ± 7) 形成的神经球数量显着高于 (p = 0.01) 比 U87MG CSC 细胞 (13 ± 2) 。TMZ 显着降低了 U87MG CSCs 的自我更新特性 (p= 0.003)。我们还观察到，与 U87MG CSCs 相比，U87EGFRvIII CSCs 对 TMZ 具有相对抗性；然而，联合使用阿法替尼和 TMZ 显着减少了两种细胞系中神经球的数量（p= 0.001）。在对照组、TMZ、阿法替尼和联合治疗组中，每个视野的 U87EGFRvIII CSC 神经球的平均数量分别为 29 ± 7、18 ± 2、7 ± 3 和 3 ± 1。

　　cMET 信号促进和丰富 GBM CSCs。在 GBM 患者标本以及几个 GBM 患者衍生的神经球的干细胞中观察到 cMET 活化。与 U87MG 相比，我们观察到 U87EGFRvIII 细胞中 cMET 的激活增加。此外，阿法替尼显着降低了 U87EGFRvIII 细胞中的 cMET 活化。为了确定 EGFRvIII 是否通过 GBM 中的 cMET 激活介导 CSC 维持，我们分析了从 U87EGFRvIII 细胞分离的 CSC 和非侧群 (NSP) 细胞中各种干性标志物的表达。与 NSP 细胞相比，我们观察到干细胞标记 Nanog 和 Oct3/4 的富集和 CSC 中 cMET 活化的增加。令人惊讶的是，CSCs 表达较低的 SOX9 和 CD15 水平，并且没有观察到巢蛋白表达的变化。有趣的是，阿法替尼治疗显着降低了 cMET 活化以及 U87EGFRvIII CSCs 的干性，而 TMZ 仅显示没有效果。为了进一步验证 cMET 信号传导在 GBM 中保持干性，我们用 cMET 抑制剂 SU11274 处理 U87EGFRvIII 细胞。我们的结果显示磷酸化/活性 cMET (pcMET-Y1234/1235) 的表达呈剂量依赖性降低，干性标志物 Nanog 和 Oct3/4 的表达降低。更多详情可咨询下方微信。