多形性胶质母细胞瘤 (GBM) 是最常见和最具侵袭性的原发性脑肿瘤。尽管手术、放疗和化疗取得了进步，但患者的平均生存期仅为 14.6 个月。在大多数 GBM 肿瘤中，酪氨酸激酶显示出增加的活性和/或表达，并积极促成治疗耐药性的发展、复发和发作；使它们的抑制成为一种有吸引力的治疗策略。我们在体外比较了 12 种酪氨酸激酶抑制剂的细胞毒性，克唑替尼（crizotinib）和达沙替尼的组合在已建立的和原代人 GBM 细胞系中成为最具细胞毒性的。联合治疗诱导凋亡细胞死亡和多倍体。此外，联合治疗导致几种酪氨酸激酶受体（例如 Met 和 EGFR）和下游效应器（例如 SRC）的表达和定位发生改变。此外，联合治疗减少了 GBM 细胞的迁移和侵袭，并防止了体外内皮细胞管的形成。总体而言，我们的研究证明了克唑替尼和达沙替尼组合在多个 GBM 细胞系中的广泛特异性。这些发现为开发用于治疗 GBM 的替代疗法提供了见解。
正在积极探索治疗和减少 GBM 复发的替代有效方法。癌症基因组图谱已经确定了几种 RTK 的扩增，例如 EGFR、ERBB2、PDGFRα、Kit、血管内皮生长因子 2 (VEGFR-2)、成纤维细胞生长因子受体 2、胰岛素受体底物 2 和 Met 。酪氨酸激酶抑制剂已成为许多类型癌症的有效癌症治疗剂，并且正在评估用于治疗 GBM。目前，139 项 I 期或 II 期临床试验使用 27 种不同的 TKI 靶向各种受体和非受体酪氨酸激酶，在全球范围内积极用于治疗 GBM。尽管已经确定了许多分子靶点，但由于 GBM 信号通路的多样性、冗余性和异质性，在肿瘤和治疗反应过程中发生变化，特定 TKI 的功效仍然值得怀疑]。此外，一部分患者的肿瘤可能具有一种以上亚型的特征。因此可以想象，药物组合的使用将提供更好的治疗结果。
本研究描述了四种已建立的和两种原代 GBM 细胞系对 TKI、克唑替尼（crizotinib）和达沙替尼组合的反应。达沙替尼抑制多种酪氨酸激酶，据报道这些酪氨酸激酶在 GBM 中过度表达或具有组成性活性，例如 SRC 家族激酶、试剂盒、巨噬细胞集落刺激因子受体、PDGFR-α 和-β、EphB1、EpHB2 和 EphB4。在我们的研究中评估的广泛选择性 TKI 的交叉检查将 SRC 鉴定为感兴趣的蛋白质。SRC 在多种细胞表面受体（如 Met、PDGFR、EGFR 和 EGFRvIII）的信号转导中起关键作用，在 25-64% 的 GBM 患者中表达。SRC参与多种细胞过程的调节，包括细胞体积调节、细胞增殖和侵袭。在本研究中考虑的细胞系中，SRC 具有组成型活性，这也在患者肿瘤样本中观察到。用于联合治疗的另一种 TKI 克唑替尼可抑制多种酪氨酸激酶，包括 Met、RON 和 ALK。在这项研究中，由于对 ALK 和 ROS1 对 GBM 的贡献缺乏了解，我们仅考虑了治疗对 Met 表达的影响。蛋白质印迹证实，SRC 和 Met 的信号通过单一和联合治疗受到抑制，而增殖和存活下游效应因子 AKT 的活性在已建立和原代细胞系中被联合治疗有效抑制。此外，联合治疗足以降低已知过表达的酪氨酸激酶的表达，并有助于 GBM 的进展和侵袭，例如 EGFR 和 FAK。
已证明达沙替尼在临床试验中具有良好的耐受性，但无论是作为单一疗法还是与厄洛替尼 、洛莫司汀或贝伐单抗联合治疗复发性 GBM，都未能提高总体生存率。达沙替尼疗效有限的原因是由于 ATP 结合盒转运蛋白（如在血脑屏障 (BBB) 上高表达的 P-糖蛋白 (P-gp) 和乳腺癌抗性蛋白）的活性，在大脑中的积累不良) 和胶质母细胞瘤细胞。我们的数据和以往研究的数据表明有限的疗效也可能是达沙替尼的细胞抑制作用而不是细胞毒性作用的结果。治疗后细胞凋亡和坏死标志物的缺失以及达沙替尼治疗 48 和 72 小时后 G1 期的增加突出了这种效果。
迄今为止，尚未完成检查克唑替尼（crizotinib）对 GBM 患者疗效的临床试验。虽然，已经启动了几项临床试验，使用小分子抑制剂测试 Met 抑制剂，例如克唑替尼 (NCT02270034) 和卡博替尼 (NCT00704288) 或针对 Met 的抗体 (NCT01632228)。克唑替尼表现出较差的 BBB 渗透性；然而，BBB 在肿瘤病变区域经常被严重破坏，并且肿瘤脉管系统的病理变化增加了对小分子的通透性。克唑替尼也是 P-gp 转运的有效抑制剂，克唑替尼治疗可能通过减少其从肿瘤组织的流出来延长与达沙替尼联合用药的疗效。有希望的是，联合治疗足以促进细胞凋亡，在去除药物后维持长达 72 小时。这是一个令人鼓舞的观察结果，因为它降低了当细胞致力于细胞死亡时出现抗药性的可能性。
达沙替尼和克唑替尼（crizotinib）的组合显示增加细胞凋亡，但也显着降低 GBM 细胞的增殖。通过蛋白质印迹、FACS和免疫细胞化学分析证实了联合处理促进细胞周期停滞在细胞周期的G2 /M期和多倍体细胞的形成。细胞周期的扰动与所有细胞系中 CD1 表达的减少有关。CD1 表达通常与从 G1/S 和 S/G2的转变有关，但是在癌细胞中，其在整个 S 和 G2/M 期的表达都很高，从而促进了视网膜母细胞瘤蛋白的组成型磷酸化。CD1 表达受 SRC 调节和 SRC 活性的下调足以降低 CD1 表达和随后的细胞增殖。然而，在克唑替尼处理的细胞中观察到 CD1 上调并且与多倍体细胞比例增加有关，在克唑替尼治疗后也观察到。
此外，我们的结果表明，联合治疗减少了迁移并减少了细胞侵袭，这两者都是转移所必需的。达沙替尼和克唑替尼（crizotinib）组合的抗侵袭潜力出现在低克唑替尼浓度下。这种效应是一个特别重要的观察结果，因为侵入周围的健康大脑最终会降低所有 GBM 标准治疗的功效。传统的化学疗法通常对入侵细胞无效，因为这些细胞会抑制它们的增殖，从而减少由促进 DNA 损伤的药物引起的损伤。此外，GBM 病变是高度血管化的，但抗血管生成疗法在 GBM 中的疗效不佳。我们的结果表明，在体外模型中，达沙替尼和克唑替尼的组合减少了血管生成和血管模拟。抗血管生成和抗侵入特性的结合是一个重要的考虑因素，因为贝伐单抗（一种抗血管生成疗法）的临床实用性受到侵入性表型的促进的限制。
总之，我们的结果表明，达沙替尼和克唑替尼（crizotinib）的组合足以促进细胞凋亡、减少细胞迁移和侵袭并消除新血管生成。这种组合足以降低对 GBM 存活和治疗抗性至关重要的信号通路的活性。这些发现表明该组合方法具有治疗潜力，需要进一步的研究来测试其在体内的功效。微信扫描下方二维码了解更多：
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