尼达尼布(nintedanib)的体外抗新血管生成作用

　　特发性肺纤维化的特征是外周肺组织进行性瘢痕形成和硬化，从而降低肺功能。在疾病过程中，肺微血管系统经历了广泛的重塑。纤维化病灶周围的血管生成增加，病灶内没有微血管。为了阐明抗纤维化药物尼达尼布（nintedanib）如何作用于血管重塑，我们在微流控芯片中使用了由原代内皮细胞和原代肺成纤维细胞制成的可灌注微血管的体外模型。微血管模型使我们能够研究尼达尼布对渗透性、血管化面积和细胞-细胞相互作用的影响。尼达尼布的抗血管生成作用在 10 nM 的最小浓度下可见，显示血管通透性显着增加。此外，尼达尼布降低了微血管的密度、直径，并影响了内皮微血管周围的成纤维细胞组织。这些结果表明，尼达尼布作用于内皮网络形成和内皮-血管周围相互作用。因此，先进的体外微血管模型可用于确定抗纤维化药物对 3D 微血管重塑的机制作用，并完善动物研究的结果。

　　先进的体外微流体模型可以实现生物动力学的可视化，消除种间差异，并减少要使用的细胞和试剂的数量。此外，这些模型提供了对血管化的可控研究，以开发片上模型，这些模型可在未来用于优化和开发个性化血管网络上的药物治疗。在这项研究中，首次利用从患者健康肺组织中获得的成纤维细胞在体外建立了一个 3D、稳定和可灌注的微血管网络。建立该网络后，我们研究了三重酪氨酸激酶抑制剂尼达尼布对体外人体微血管系统的影响。我们在体外证明了尼达尼布对血管通透性、血管密度、血管形态、内皮-成纤维细胞相互作用和成纤维细胞侵袭的影响。

　　在我们的模型中测试尼达尼布（nintedanib）之前，我们评估了其对浓度高达 100 nM 的 HUVEC 和 NL-FB 的单一培养和共培养的细胞毒性。Alamar blue 和活死染色分析表明，当使用尼达尼布进行高达 100 nM 的处理时，所有细胞培养物都保持其活力和增殖。这一结果与之前的报告形成对比，其中用尼达尼布处理 VEGF 或 bFGF 刺激的 HUVEC 导致细胞增殖和凋亡的抑制，EC50值分别小于 10 和 290 nM。然而，在本研究中，HUVECs 被 VEGF 和 FGF（存在于完全补充的 EGM-2 培养基中）刺激，因此预计它们对尼达尼布的毒性作用更持久。以前的研究表明，在尼达尼布浓度高达 1 μM 时，没有证据表明对人肺成纤维细胞有急性毒性。研究还表明，尼达尼布仅在浓度大于 500 nM 时才显着抑制肺成纤维细胞的增殖。

　　有趣的是，虽然尼达尼布（nintedanib）对细胞活力和增殖没有不利影响，但当在微血管形成过程中在芯片上给药时，它会在低至 10 nM 的浓度下影响体外微血管系统。为了直接比较，我们选择的片上尼达尼布浓度约为其在人血浆中浓度的 0.7 至 1.4 倍。

　　此外，尼达尼布（nintedanib）治疗的体外血管显示血管壁的血管渗漏显着增加。尼达尼布的片上给药使体外微血管的通透性增加了三个数量级。尼达尼布还通过干扰内皮细胞和成纤维细胞之间的旁分泌 PDGF 信号传导，阻止成纤维细胞延长和包裹内皮血管段。PDGF 负责血管壁中周细胞和成纤维细胞的化学吸引和增殖。在 IPF 中，除了成纤维细胞外，在内皮细胞和上皮细胞中还发现了 PDGF，这表明 PDGF 在血管重塑中的作用。抑制 PDGF/PDGFR 信号级联会干扰成纤维细胞的化学吸引和迁移，并导致形成不稳定的微血管网络。已知成纤维细胞的存在直接影响体外微血管的通透性和形态。血管周围细胞包裹血管，稳定细胞间连接，增加基底膜沉积，从而降低微血管的通透性。因此，高渗漏可以通过缺乏血管周围覆盖和通过 PDGF 信号传导的连接稳定性来解释。

　　阿克曼等人据报道，尼达尼布（nintedanib）将体内血管间距增加了 1.7 倍，血管直径从 5.1 ± 1.38 减小到 3.71 ± 1.0 μm，表明血管密度显着降低。这些结果与我们的数据一致，表明尼达尼布治疗显着降低了体外血管密度和直径。除了在血管生成过程中调节多种信号通路和控制内皮细胞外，VEGF 还是血管形成和发芽的主要调节因子。虽然 VEGF 在血管生成中的确切机制尚未完全阐明，但已经报道了 VEGF-VEGFR 结合的多种生物学反应：抑制内皮细胞凋亡、调节这些细胞的迁移和增殖、增加血管通透性和维持血管完整性。为了调节发芽，VEGF 的空间分布会放松细胞间的粘附，指导尖端细胞迁移并决定茎细胞的增殖。抑制 VEGF/VEGFR 信号传导可能通过促进内皮细胞凋亡对血管完整性产生有害影响。此外，VEGF 阻断可调节血管发芽并减少毛细血管分支。有趣的是，用特异性抗体阻断 VEGF 可将毛细血管样管的数量减少多达 70%，进一步证实了我们的发现。FGF 是肝素结合生长因子，可诱导内皮细胞增殖和迁移。FGF 也是通过纤溶酶原激活物表达促进 ECM 降解的血管生成初步步骤的介质。抑制 FGF/FGFR 信号可以限制内皮细胞迁移，防止 ECM 降解，并显示出与 VEGF/VEGFR 阻断类似的发芽效果。

　　先进的体外微血管模型为研究尼达尼布（nintedanib）等治疗药物的作用模式开辟了新的前景。这些实验平台可以解决药物对血管生成和血管生成的影响的基本问题，并可用于开发和优化未来个性化脉管系统模型中的药物治疗。总之，我们的工作表明，临床相关浓度的尼达尼布治疗不会影响细胞活力，但会通过放松血管屏障完整性、增加通透性、缩小微血管、降低血管密度和阻止内皮血管周围的成纤维细胞组织来显着影响新血管生成。尼达尼布对微血管结构的影响先前已在体内进行过研究，我们的人体微血管体外 3D 模型代表了一种令人兴奋的方法，因为它允许研究尼达尼布对分离的人体微血管的影响，并比体内研究更详细地解决细胞-细胞相互作用。微信扫描下方二维码了解更多：