外源性生长因子迈吉宁/曲美替尼的影响

　　已经表明，V600EBRAF 黑色素瘤细胞对靶向治疗的反应受生长因子的影响。我们研究了三种不同生长因子 bFGF、EGF 和 HGF 单独或联合使用对从手术标本建立的V600EBRAF 黑色素瘤细胞群对威罗非尼和曲美替尼（迈吉宁）的反应的影响，分别针对V600EBRAF 和 MEK1/2 。

　　我们报告说，V600EBRAF 黑色素瘤细胞群的增殖和表型不受外源性生长因子的显着影响。细胞周期中的细胞分布和CCND1表达以及对黑色素瘤发展和维持至关重要的信号通路的活性，包括 RAF/MEK/ERK 通路、WNT/β-连环蛋白通路和 NF-κB 信号通路，都不受不同生长的存在的影响因素。我们进一步表明vemurafenib 和曲美替尼消除了 ERK1/2 的活性，使细胞停滞在 G0/G1细胞周期阶段，引发细胞凋亡，诱导CXCL8、CCND1和CTGF表达的变化以及 Ki-67高和 CD271高细胞的频率。然而，在存在不同生长因子的情况下，这些影响是相似的。有趣的是，在药物治疗前长达 4 个月的时间内，在没有外源生长因子 bFGF、EGF 和 HGF 的情况下生长的黑色素瘤细胞也获得了可比较的结果。

　　我们得出结论，外源性生长因子 bFGF、EGF 和 HGF 的组成或缺乏不会显着影响V600EBRAF 黑色素瘤细胞的活力和表型及其对威罗非尼和曲美替尼（迈吉宁）的体外反应。我们的结果质疑这些生长因子在用于培养V600EBRAF 黑色素瘤细胞的培养基中的必要性。

　　本研究采用的策略是用外源性 bFGF、EGF 和 HGF 替代黑色素瘤基质的旁分泌贡献，在培养基中单独或联合提供，然后广泛研究黑色素瘤细胞表型和细胞对威罗非尼的反应的可能改变和曲美替尼（迈吉宁）。或者，我们评估了相同的参数，同时在缺乏外源 bFGF、EGF 和 HGF 的培养基中培养黑色素瘤细胞约 4 个月，使细胞完全依赖自分泌生长因子的产生。我们的研究没有揭示这些生长因子对黑色素瘤活力和表型的任何实质性影响。威罗非尼和曲美替尼对活力、细胞周期、Ki-67高（密集增殖）和 CD271高百分比的影响（茎状）黑色素瘤细胞和对黑色素瘤发展和维持至关重要的信号通路的活性，包括 RAF/MEK/ERK 通路、WNT/β-连环蛋白通路和 NF-κB 信号通路，无论生长条件如何，都非常相似，至少在治疗的前 72 小时。我们不能排除生长因子依赖性信号转导在耐药性发展后期变得过度激活。CXCL8、CCND1、DKK1和CTGF的基因表达同样被药物改变，而与生长条件无关。曲美替尼和威罗非尼显着降低CCND1的表达，在缺乏外源性 bFGF 的培养基中被曲美替尼更有效地减少。然而，这并没有导致细胞周期 G1期的细胞积累更高，这表明尽管在 cyclin D1 转录物水平上观察到显着差异，但它们不足以影响细胞周期中的细胞分布。在V600EBRAF 黑色素瘤细胞中，细胞周期蛋白 D1 是组成型表达的。它的诱导不依赖于生长因子，主要依赖于 MEK 活化和磷酸化 ERK 的核积累。这解释了为什么威罗非尼和曲美替尼显着降低了它的表达。然而，其他途径也可能参与CCND1如在其他细胞类型中所示的表达，这可能有助于在存在不同生长信号的情况下使用药物时观察到的细胞周期蛋白 D1 转录水平的微小差异。

　　虽然V600EBRAF 黑色素瘤细胞的生长因子独立性并不令人惊讶，并且已经观察到配体刺激对激酶成瘾细胞的增殖影响很小或没有影响，但生长因子对威罗非尼和曲美替尼（迈吉宁）的细胞反应缺乏影响是鉴于先前公布的结果很有趣。已经证明，靶向治疗对靶向通路上游元件的基质介导的影响导致药物有效性的降低。仔细检查体外这些研究报告的结果表明，这种现象并不普遍。EGF、HGF 和 FGF 仅在一些测试的V600EBRAF 黑色素瘤中强烈拮抗威罗非尼敏感性；5 个中的 HGF、3 个中的 EGF 和不超过 8 个黑色素瘤细胞系中的不同 FGF [1]。仅在 3 个黑色素瘤细胞系中的一个 (SK-MEL-5) 中观察到重组 HGF (0.25–50 ng/ml) 对威罗非尼类似物 (PLX4720) 抑制增殖的显着影响。在另一项研究中，七分之一的黑色素瘤细胞系可以通过 HGF 或 FGF 从威罗非尼诱导的生长抑制中解救出来，但 EGF 没有，并且在其他细胞系中仅观察到“部分解救”。在另外 12 个V600E中BRAF 黑色素瘤细胞系，HGF 仅在 5 个细胞系中显着减弱威罗菲尼的敏感性。此外，在本研究中，维罗非尼处理的 BRAF 突变黑色素瘤细胞中 cMET 表达与 HGF 拯救之间的相关性并不高 (r2= 0.56)，这表明 cMET 对微环境介导的 BRAF 抑制剂耐药性的贡献仍有待阐明。最近证明，cMET 临床评分不是 BRAF 抑制剂治疗的统计学显着预测因素，并且基质或实质 HGF 表达水平并不表明肿瘤对 BRAF 抑制剂的反应。尽管在本研究中没有研究配体诱导的受体活性，但在所有六个患者来源的样本中，没有一个受体可以被测试的生长因子激活的可能性很低。

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