索拓西布(AMG-510)对KRAS G12C结构的影响

　　KRASG12C突变体通常与人类癌症相关，而索拓西布（AMG-510）作为一种有前途的 KRASG12C共价抑制剂，在临床试验中取得了令人惊讶的疗效。然而，KRAS G12C和 索拓西布之间的相互作用机制尚不完全清楚。在这里，我们对 KRAS G12C-AMG 510的复合物进行了全原子分子动力学模拟，以探索这种共价抑制剂对 KRASG12C构象变化的影响。.基于已知的 KRAS 晶体结构构建了 PCA（主成分分析）模型，以区分不同的构象（活性、非活性和其他）。通过将模拟轨迹映射到 PCA 模型上，我们观察到与 AMG-510 结合的 KRASG12C的构象主要集中在非活性构象中。进一步分析表明，索拓西布降低了两个开关区域的灵活性，使 KRASG12C-AMG-510 的复合物限制在非活性构象中。同时，我们还通过计算结合能确定了 KRASG12C和 索拓西布之间的关键相互作用残基。最后，我们构建了一系列 KRAS 第二位点突变系统（即 KRASG12C/mutations) 对潜在的抗性突变进行大规模筛选。通过进一步结合 MD 模拟和 PCA 模型，我们不仅成功地概括了目前已知的索拓西布的抗性突变，而且还提出了一些新的潜在抗性突变。总之，这些结果拓宽了我们对 AMG-510 在原子水平上对 KRASG12C突变体构象变化的影响的认识，从而为候选药物的改进和优化提供了重要提示。

　　在 96 个实验结构的 PCA 结果中，前三个分量捕获了与两个开关区域相关的残基距离的 85% 以上的方差，这表明它们可以清楚地描述 KRAS 的构象空间。通过将原始的 96 个结构投影到前三个 PC 构建的 3D 坐标上，我们观察到这些结构分为三个主要组：两个密集簇，分别代表 GTP 结合的活动构象和 GDP 结合的非活动构象，和对应于其他构象的稀疏簇。基于前三个PC，这96个的成对欧几里得距离结构也被测量和聚集。然而，我们也观察到其他构象类型的一些结构与活性结构混合，暗示其他构象类型往往是活性状的。同时，我们设计了一个简单的规则来对 KRAS 结构的不同构象进行分类。结果表明，通过 Leave-One-Out 测试，96 个结构中的 89 个（准确率 = 92.7%）的构象被正确分类，表明该构象状态分类器的性能令人满意。

　　为了进一步探索索拓西布对 KRASG12C构象状态的影响，我们将有和没有共价抑制剂结合的 KRASG12C的 MD 模拟轨迹投影到已建立的 PCA 模型上，以定量表征构象状态的变化。一般来说，大多数 KRASG12C-AMG-510 结构 (88.71%) 在模拟过程中倾向于处于非活动构象，其次是其他构象 (11.10%) 和活动构象 (0.19%)。关于不与共价抑制剂结合的 KRASG12C的构象分布（KRASG12C-apo), 占主导地位的构象仍然不活跃，尽管与绑定索拓西布的系统相比，比例下降到 62.04%。此外，从模拟轨迹采样的帧中有 23.05% 属于活跃构象，其他构象也占14.91%。正如预期的那样，我们可以从上述结果中得知，从两个 KRASG12C的 800 ns MD 模拟轨迹中提取的大部分帧都被归类为非活动构象，因为它们是 GDP 绑定的。然而，在没有 AMG-510 施加的约束的情况下，来自 KRASG12C -apo的结构在模拟过程中具有活性或其他构象。当被索拓西布（AMG-510）共价靶向时，KRASG12C的所有结构的比例MD 模拟生成的属于非活性构象的显着高于 KRASG12C -apo。这表明索拓西布（AMG 510）可以使 KRASG12C持续处于 GDP 绑定的非活动状态，然后阻止其转换为活动状态的过程。

　　RAS 家族的催化结构域具有相对保守的构象，除了两个开关区（SI 和 SII），其构象影响与其他蛋白质的相互作用。为了进一步说明索拓西布（AMG-510）对 KRASG12C结构的影响，我们还进行了 RMSF 分析来比较两个系统的灵活性。在KRAS G12C-apo系统的SI和SII中出现了两个波动较大的峰，这与先前关于这些区域的动态结构特征的观察结果一致。然而，对于 KRASG12C-AMG-510，RMSF 值显示出显着下降，尤其是对于 SII 区域。在 SI 区域，KRAS G12C -AMG 510 的波动与 KRASG12C-apo 的情况相比不到一半（平均RMSF值：1.080 vs. 2.403），而两个系统中 SII 区域波动的比率接近三分之一（平均 RMSF 值：0.613 对 1.854）。发现与后一种结构相比，前一种结构在两个开关区域的灵活性较低。总的来说，RMSF 分析表明索拓西布通过降低其灵活性使 KRASG12C突变体稳定地处于非活动状态。2020 年，Pantsar 通过 10 μs MD 模拟探索了 KRASG12C和索拓西布的动态交互，他还发现索拓西布降低了 switch-II 区域的灵活性。然而，我们的模拟结果进一步观察到在 800 ns MD 模拟期间 switch-I reigon 的波动减少，这在 Pantsar 的工作中未能被检测到。这两个模拟结果之间的差异可能归因于不同的模拟设置。

　　此外，我们计算了 RMSD 值以及两个系统之间的仿真时间。结果表明，在 800 ns 的模拟过程中，整个催化结构域的 Cα RMSD 值在 KRASG12C-AMG-510 系统中保持在约 1 Å。相比之下，KRASG12C -apo的 RMSD 值在前 500 ns 模拟中稳定在 1 左右，但在 500-800 ns 模拟时间中显示出显着增加。我们进一步检查了三个区域（没有两个开关区域的整个催化域，SI 和 SII）的 RMSD 值，可以推断两个系统之间 RMSD 值的变化主要来自两个开关区域。

　　为了探索索拓西布的共价结合对 KRASG12C的亲和力和 GDP 的影响，我们提取了两个系统的最后 300 帧，以通过 MM/PBSA 计算结合自由能。计算的 KRASG12C-AMG-510/GDP 和 KRASG12C-apo /GDP 的 ΔG结合值分别为 -898.832 和 -720.251 kcal/mol。一般来说，两个系统中的低结合自由能与先前的实验观察结果一致，即 KRAS 和核苷酸在细胞中具有高亲和力。KRASG12C-AMG-510/GDP 复合物中 ΔG结合的减少表明索拓西布（AMG-510）的结合将进一步增强 KRASG12C与 GDP 之间的亲和力。此外，除 ΔGSA项外，其余三个高能分量（气相中的ΔEvdw和 ΔEele ，ΔGPB) 主要导致这两个系统中的 ΔG结合差异。

　　在目前的工作中，我们结合多方面的计算方法，包括 MD 模拟、MM/PBSA 计算和轨迹分析，来研究 KRASG12C和 AMG-510 之间的分子相互作用机制。基于 PCA 的结构状态分类器定量识别帧提取与来自 KRASG12C -apo 系统的那些相比，来自 KRASG12C-AMG-510 系统的非活性构象在 800 ns MD 模拟期间的比例更高。然后，轨迹分析反映两个切换区域的灵活性降低是KRASG12C的主要原因构象变化。此外，索拓西布（AMG-510）与 T35 形成疏水相互作用，以固定 SI 区域的波动并阻碍核苷酸结合位点的开放。同时，MM/PBSA 计算表明索拓西布增强了 KRASG12C和 GDP 的亲和力。这些结果表明，索拓西布（AMG-510）降低了 KRASG12C中两个开关区域的灵活性，使其处于 GDP 结合状态，然后阻断了 KRASG12C的激活。

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