维加特/尼达尼布对肺成纤维细胞的抗纤维化作用

　　特发性肺纤维化（IPF）是一种预后不良的进行性肺病。与安慰剂相比，血管内皮生长因子受体 (VEGFR)、血小板衍生生长因子受体 (PDGFR) 和成纤维细胞生长因子受体 (FGFR) 的激酶抑制剂尼达尼布（商品名：维加特）显着降低了用力肺活量的下降率。

　　确定维加特/尼达尼布对原代人肺成纤维细胞的体外作用。方法：从 IPF 患者和非纤维化对照的肺中分离出成纤维细胞。我们评估了 VEGF、PDGF-BB 和碱性 FGF (bFGF) ± 尼达尼布对以下方面的影响：(i) VEGFR、PDGFR 和 FGFR 的表达/激活，(ii) 细胞增殖，(iii) 基质金属蛋白酶 (MMP) 的分泌, (iv) 金属蛋白酶组织抑制剂 (TIMP), 和 (v) 胶原蛋白。

　　结果

　　IPF 成纤维细胞比对照表达更高水平的 PDGFR 和 FGFR。PDGF-BB、bFGF 和 VEGF 引起了一种被尼达尼布阻止的促增殖作用。尼达尼布增强pro-MMP-2的表达，抑制TIMP-2的表达。尼达尼布抑制转化生长因子-β 诱导的胶原分泌。

　　结论

　　我们的数据表明维加特尼达尼布在 IPF 成纤维细胞中具有显着的抗纤维化作用。这种作用包括药物的抗增殖能力，以及它对细胞外基质的作用，细胞外基质的降解似乎得到了增强。

　　在这项研究中，我们研究了维加特尼达尼布对从 IPF 患者和非纤维化对照肺获得的原代人肺成纤维细胞的增殖能力以及细胞外基质代谢的体外影响。我们发现受体酪氨酸激酶抑制剂尼达尼布阻止了生长因子诱导的 IPF 和对照成纤维细胞的增殖。此外，尼达尼布显着降低了生长因子诱导的胶原合成。有趣的是，该药物上调了 pro-MMP-2 的分泌，但下调了其抑制剂 TIMP-2。

　　IPF 是一种进行性肺病，诊断后的中位生存时间为 2.5 至 3.5 年，治疗选择有限。导致 IPF 的病理机制尚不完全清楚，然而，它们最终会导致间充质细胞数量增加和间质中 ECM 成分的积累。维加特/尼达尼布是一种酪氨酸激酶的细胞内抑制剂，已被证明具有良好的抗肿瘤/抗增殖功效，并对 IPF 患者产生有益效果。尼达尼布的靶点包括 PDGFR、FGFR 和 VEGFR，它们已被证明与肺纤维化有关。

　　使用从 IPF 肺和非纤维化对照肺获得的原代人肺成纤维细胞，我们发现与对照相比，IPF 细胞表达更高水平的 PDGFR 和 FGFR。这一发现与之前的数据一致，这些数据显示 IPF 患者的肌成纤维细胞样细胞中 FGFR1 的表达增强，并且在啮齿动物肺纤维化模型中上调了 PDGFRα 的表达。虽然我们在纤维化和非纤维化细胞中发现相似水平的 VEGFR，但其他人报告了 IPF 患者中 VEGFR1 的表达增加。然而，在后一项研究中，可溶性 VEGFR 是在支气管肺泡灌洗液中测量的，而我们使用的是来自纯原代人肺成纤维细胞的蛋白质提取物，这使得比较数据变得困难。

　　PDGF-BB 和 bFGF 是间充质细胞的有效促有丝分裂和趋化因子，这两种因子在 IPF 患者中均显示升高。因此，我们在来自 IPF 和非纤维化对照肺的原代人肺成纤维细胞中观察到 PDGF-BB 和 bFGF 的强有丝分裂作用。重要的是，观察到的有丝分裂作用在对照细胞中比在 IPF 细胞中更强（PDGF-BB 为 2 倍，bFGF 为 1.7 倍），这与先前的数据一致，表明正常和 IPF 对生长因子的反应不同成纤维细胞]。VEGF 是新血管形成的重要调节因子，最近的数据支持了它可能与纤维化疾病有关的假设。在这方面，在肺纤维化的动物模型中报告了显着的血管变化。目前，VEGF 在 IPF 中的作用尚不清楚，因为 VEGF 血浆水平与特发性间质性肺炎患者的放射纤维化评分显着相关，但据报道 IPF 患者支气管肺泡灌洗液中 VEGF 水平降低。尽管 VEGF 被认为是内皮细胞的特异性有丝分裂原，但我们观察到 VEGF 在 IPF 以及非纤维化对照成纤维细胞中的有丝分裂作用，仅在后者中达到统计学意义。

　　根据先前的数据，维加特/尼达尼布在 IPF 和非纤维化对照细胞中以浓度依赖性方式抑制 PDGF-、FGF-和 VEGF 诱导的成纤维细胞增殖。在我们的原代人成纤维细胞中，我们观察到与 IPF 成纤维细胞相比，尼达尼布在非纤维化细胞中的拮抗能力明显更强。IPF 细胞对尼达尼布敏感性降低的原因可能是 IPF 细胞中较高的 PDGFR 和 FGFR 表达。此外，与我们关于胶原蛋白分泌的发现相反，只有高浓度的尼达尼布可阻止生长因子诱导的胶原蛋白分泌，而低浓度的尼达尼布可有效抑制细胞增殖。

　　ECM 的过度积累是 IPF的一个标志，因此我们研究了尼达尼布对 ECM 代谢的影响。我们发现维加特/尼达尼布诱导了MMP-2的活性和蛋白水平，并降低了TIMP-2的水平。MMP 是一类分泌的含锌内肽酶，可降解 ECM 的蛋白质，而 TIMP 是它们的主要生理抑制剂 。MMP-2 和 MMP-9 都代谢各种 ECM 蛋白，包括 IV 型和 V 型胶原蛋白和明胶。MMPs 作为非活性前体分泌，必须在细胞外空间中被激活。MMP-2 可被 I 型胶原蛋白和凝血酶激活，但也通过涉及 TIMP-2的膜型 MMP 依赖性途径。MMP 和 TIMP 之间的不平衡可能与 ECM 在纤维发生中的积累有关。因此，据报道 TIMP 水平的增加大于 MMP-2 的水平，并且这种不平衡将有利于 ECM 蛋白的增强沉积。有趣的是，TGF-β 诱导的小鼠肺纤维化主要是由于 TIMP 上调，最近的一项研究表明，小鼠肺泡巨噬细胞过度表达 MMP-9 减弱了博来霉素滴注后的纤维化反应。因此，如果 IPF 中 TIMP 升高，那么减少成纤维细胞分泌 TIMP-2 的药物可能是治疗这种破坏性疾病的有力工具。

　　为了进一步研究维加特/尼达尼布的抗纤维化潜力，我们确定了该药物对 PDGF-、FGF-和 VEGF 诱导的胶原分泌的影响。与其他人类似，我们观察到在成纤维细胞中用三种生长因子刺激后胶原蛋白分泌没有显着调节。

　　TGF-β 是众所周知的胶原蛋白生成刺激物，是纤维发生的关键介质，TGF-β 诱导的干扰在 IPF 中至关重要。正如预期的那样，TGF-β 上调 IPF 和对照成纤维细胞中的总胶原蛋白，并且这种作用被最高浓度的尼达尼布 (1 μM) 所拮抗。为了阐明这种效应的潜在机制，研究了 TGF-β 的几种下游信号通路。可以证明，维加特/尼达尼布抑制 TGF-β1 诱导的 MAP 激酶 ERK1/2 和蛋白酪氨酸激酶 c-Abl 的磷酸化。在原代人肺成纤维细胞中 TGF-β 刺激后 Smad2/3 缺乏磷酸化与先前的数据一致。TGF-β 刺激 c-Abl 酪氨酸激酶的发现与其他人一致，将 c-Abl 确定为 TGF-β 信号传导的重要元素，并且对于 TGF-β 诱导的 ECM 蛋白合成至关重要。ERK1/2 是众所周知的非经典 TGF-β 信号传导成分，抑制 ERK 可抑制体外胶原蛋白表达。因此，根据我们的数据，我们认为尼达尼布对 TGF-β 诱导的胶原蛋白分泌的拮抗作用——至少部分是由于对 c-Abl 和/或 ERK1/2 的抑制。我们假设激酶抑制剂 nintedanib 抑制 c-Abl 酪氨酸激酶，类似于甲磺酸伊马替尼，一种对 PDGFR 和 cAbl 具有特异性的酪氨酸激酶抑制剂。最后，ERK1/2 MAP 激酶不是 TGF-β 特异性的，但也是对 PDGF 受体激活有反应的下游靶标。总之，我们的数据表明，尼达尼布不仅能够抑制 PDGF 和 FGF 的促纤维化作用，而且还能够消除 TGF-β（组织纤维化的关键介质）的作用。

　　据我们所知，这是第一项研究维加特/尼达尼布对从 IPF 患者获得的原代人肺细胞中的作用的研究。我们的体外数据表明，维加特/尼达尼布在源自 IPF 患者的原代人肺成纤维细胞中具有显着的抗纤维化作用。这种作用包括药物的抗增殖作用，以及它对 ECM 的作用，ECM 的降解似乎得到了加强。维加特/尼达尼布的联合抗纤维化活性可能会影响 IPF 等纤维化肺病的进展过程。

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