克唑替尼(Xalkori)在 ALK 阳性间变性大细胞淋巴瘤中的抗肿瘤作用

　　间变性淋巴瘤激酶阳性间变性大细胞淋巴瘤 (ALK+ ALCL) 主要发生在儿童和年轻成人中。他们的治疗基于积极的化疗，并不是最佳的，因为 ALCL 患者仍然可以预期 30% 的 2 年复发率。肿瘤复发非常具有侵袭性，其潜在机制尚不清楚。克唑替尼（Xalkori）是最先进的 ALK 酪氨酸激酶抑制剂，已在临床上用于治疗 ALK 相关癌症。然而，已经出现了克唑替尼逃逸机制，从而阻止了其在一线 ALCL 治疗中的应用。自噬过程已被提议作为消除对酪氨酸激酶抑制剂的抗性的下一个目标。在这项研究中，我们研究了在进行 ALK 失活（使用克唑替尼或 ALK 靶向 siRNA）的 ALCL 细胞中自噬是否被激活。经典的自噬读数，例如通过电子显微镜和 LC3-B 标记翻转测定的自噬体可视化/定量，用于证明 ALK 失活后的自噬诱导和通量激活。这被证明在联合 ALK 和自噬抑制后对细胞活力和克隆形成测定具有细胞保护作用。总之，我们的结果表明，克唑替尼和氯喹（两种已经在临床上使用的药物）联合治疗可能对 ALK 阳性 ALCL 患者有益。这被证明在联合 ALK 和自噬抑制后对细胞活力和克隆形成测定具有细胞保护作用。

　　在这项研究中，我们证明克唑替尼（Xalkori）在 ALK 阳性 ALCL 细胞系中诱导自噬，这一结果在此特定淋巴瘤亚群中以前从未报道过。由于自噬抑制（通过药理学抑制或通过 siATG7 介导的方法）增强 ALK 失活的抗肿瘤活性（通过克唑替尼治疗或通过 siALK 介导的方法），我们的结果表明自噬可以作为一种生存机制在治疗挑战的 ALK 阳性 ALCL 细胞中。ALK 以前与自噬、胶质母细胞瘤和克唑替尼耐药的 NSCLC 细胞系有关，然而在这两项研究中，ALK 酪氨酸激酶（胶质母细胞瘤中的全长 ALK 受体和 NSCLC 中的 EML4-ALK 融合癌蛋白）不是治疗的直接目标。在胶质母细胞瘤细胞系中，大麻素治疗后诱导自噬（作用于大麻素受体），而在克唑替尼耐药的 NSCLC 细胞中，高剂量（1 至 8 μM）克唑替尼用于具有 EML4-ALK 缺失的细胞中。因此，可以考虑克唑替尼在那些耐药NSCLC细胞系中的另一个靶点。因此，我们相信这项 ALCL 研究是第一个揭示在药理学和分子 NPM-ALK 失活时诱导自噬的研究。事实上，我们的体外结果表明，在任一克唑替尼治疗后不久，自噬反应就会启动并激活（血浆浓度与接受 ALK 肿瘤治疗的患者相同) 或在 ALCL 细胞中 siRNA 介导的特异性 ALK 抑制后。我们观察到五个互补的结果，这些结果支持 ALK 抑制后的自噬反应：1）增加 AVO；2) 电子显微镜鉴定的自噬体数量增加；3) 增加 LC3-II 免疫组化染色和重新定位到自噬体膜；4) 自噬通量增加（在 ALK 失活和氯喹联合处理后通过蛋白质印迹观察到 LC3-II 积累）；5) 自噬基因表达增加。为了破译这种克唑替尼诱导的自噬是否影响细胞死亡或细胞存活功能，我们进行了几种测定，测试细胞活力、克隆形成存活、细胞凋亡和 ALCL 细胞在体内形成异种移植肿瘤的能力.这些试验一起证明了 ALCL 中 ALK 失活后自噬的细胞保护作用。事实上，我们发现：1) 在联合 ALK 和自噬药理学抑制（使用克唑替尼和氯喹或 3-甲基腺嘌呤）后，这些药物对降低细胞活力具有协同（而不仅仅是累加）作用；2) 正如 DA Gewirtz 最近强调的那样，使用针对 ATG7 的 siRNA 进行的自噬分子失活本身并没有引起细胞活力的丧失。值得注意的是，在 ATG7 下调后仍观察到自噬和 ALK 共抑制的增强作用；3) ALK 失活与自噬抑制相结合，驱使细胞走向凋亡/坏死细胞死亡；4) 克唑替尼和氯喹联合治疗大大降低了 ALK 阳性 Karpas-299 克隆形成的存活率，明确证明自噬具有细胞保护功能，并损害异种移植肿瘤的生长。

　　总之，这些结果强烈表明 ALK 和自噬抑制的组合可能有利于 ALK 依赖性 ALCL 的治疗，这是一种以前从未考虑过的治疗组合。ALK 阳性 ALCL 患者目前正在接受积极的化疗（环磷酰胺、羟基多柔比星、癌蛋白和泼尼松 (CHOP)）。使用克唑替尼（Xalkori）治疗 ALK 阳性 ALCL 目前正在争论中。在一些复发性 ALK 阳性 ALCL 的成年患者以及一项 I 期临床试验中报告了对克唑替尼的良好反应。此外，最近一项使用克唑替尼作为单一疗法的临床研究对 11 名对细胞毒疗法耐药/难治的成年 ALCL 患者进行了研究。他们的研究结果表明，克唑替尼具有强大的抗肿瘤活性，具有持久的反应和良好的安全性，鼓励未来将克唑替尼用作一线治疗。然而，已经在复发患者中发现了赋予克唑替尼耐药性的 ALK 突变。因此，根据我们的新数据，我们提出克唑替尼诱导的自噬，通过其细胞保护功能，可以让一些细胞逃脱靶向治疗并在休眠状态下存活，正如 White 和 DiPaola所提出的，并在卵巢癌和胃肠道间质瘤 (GIST) 模型。这种休眠状态可能被肿瘤细胞用来发展和获得对克唑替尼的耐药性，从而允许随后的肿瘤复发。因此，与先前关于伊马替尼治疗的 CML 或 GIST 的研究一致，表明自噬抑制可能代表增强对酪氨酸激酶抑制剂敏感性的新策略，我们目前的工作支持克唑替尼耐药和随后的 ALCL 肿瘤复发可能被预防或预防的概念。通过阻断自噬而减少。然而，在考虑 ALCL 患者治疗方案中的自噬抑制之前，需要进一步的临床和基础研究来证明在克唑替尼治疗后人类肿瘤中确实会发生细胞保护性自噬，并更好地了解克唑替尼（Xalkori）如何机械地触发自噬诱导。据报道它在 NPM-ALK的下游被激活。对羟氯喹（或新的改进的自噬抑制剂）的进一步研究对于确定应用于患者实现自噬抑制的剂量、频率和治疗持续时间也是必不可少的。最后，除了 ALK 依赖性 ALCL 之外，本研究还应促进进一步研究调节自噬在其他 ALK 相关恶性肿瘤中的作用，这些恶性肿瘤具有不同的 ALK 融合或过表达/激活的全长 ALK 癌基因。

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