索拉非尼(Sorafenib)抑制人免疫细胞中的JAK-STAT信号转导

　　索拉非尼（Sorafenib）是一种口服多激酶抑制剂，最初是作为 Raf 激酶抑制剂开发的。我们假设索拉非尼也会对免疫细胞中的细胞因子信号通路产生抑制作用。来自正常供体的外周血单个核细胞 (PBMC) 用不同浓度的索拉非尼处理，并用 IFN-α 或 IL-2 刺激。通过流式细胞术测量 STAT1 和 STAT5 的磷酸化，并通过免疫印迹分析确认。通过 qPCR 测量 IFN-α- 和 IL-2 刺激的基因表达的变化，并通过 ELISA 评估细胞因子产生的变化。在接受每天两次 400 mg 索拉非尼之前和之后从癌症患者中获得冷冻保存的 PBMC。将患者 PBMC 解冻，用 IL-2 或 IFN-α 刺激，并评估 STAT1 和 STAT5 的磷酸化。用 10 μM 索拉非尼预处理 PBMC，在用 IFN-α 或 IL-2 处理后降低了 STAT1 和 STAT5 磷酸化。在来自健康供体的 PBMC 中，在一系列浓度的索拉非尼 (5-20 μM)、IL-2 (2-24 nM) 和 IFN-α (101- 106U/mL)。这种效应在免疫细胞亚群中观察到，包括 T 细胞、B 细胞、NK 细胞、调节性 T 细胞和髓源性抑制细胞。索拉非尼预处理还抑制了 PBMC 表达的 IFN-α 和 IL-2 调节基因，并抑制 NK 细胞产生 IFN-γ、RANTES、MIP1-α 和 MIG 以响应 IFN-α 刺激。接受索拉非尼治疗的患者的 PBMC 对 IL-2 和 IFN-α 治疗的反应性降低。索拉非尼（Sorafenib）是一种 Raf 激酶抑制剂，可能对免疫效应细胞中细胞因子诱导的信号转导产生脱靶效应。

　　我们假设索拉非尼（Sorafenib）通过免疫效应细胞中的 JAK-STAT 通路对 IL-2 和 IFN-α 信号转导产生脱靶效应。我们的研究确定了以下内容：首先，在体外应用于 PBMC 的治疗浓度的索拉非尼足以抑制 STAT1 和 STAT5 的磷酸化，分别响应 IFN-α 和 IL-2 的刺激，无论细胞因子浓度如何。其次，通常由 IFN-α 和 IL-2 刺激的基因的表达和免疫细胞细胞因子的产生因先前用索拉非尼治疗而降低。第三，索拉非尼对几乎所有免疫细胞区室都有影响，包括具有免疫抑制作用的免疫细胞，如调节性 T 细胞和 MDSC。最后，索拉非尼体内治疗在用 IFN-α 和 IL-2 刺激后导致 STAT1 和 STAT5 的磷酸化降低。

　　虽然之前的研究表明索拉非尼（Sorafenib）治疗会降低免疫细胞的活化和功能，但这些研究都没有研究特定机制，例如索拉非尼对细胞因子信号传导的影响。其他研究已经寻找索拉非尼对药物设计靶点 Raf/Ras/MEK 通路影响的证据。本研究首次检验了索拉非尼治疗对免疫细胞中 JAK-STAT 信号通路的直接影响。使用细胞内流式细胞术，显示在体外用治疗浓度的索拉非尼预处理 PBMC导致 IL-2、IFN-α 和 IFN-γ 信号中间体的磷酸化降低。这些发现通过免疫印迹分析得到证实，并且还证明了 IL-6 诱导的 STAT3 磷酸化降低。重要的是要注意，虽然免疫印迹结果与流式细胞术的结果并不精确相关，但这是两种不同的检测方法，采用不同的方法制备细胞。此外，之前已经确定，通过流式细胞术测量的磷酸化 STAT1 的总水平与由 STAT1 与特定启动子区域结合驱动的 IFN 刺激基因的转录直接相关。重要的是，我们已经确定这种现象适用于体外多个免疫亚群在一小部分癌症患者中。

　　索拉非尼（Sorafenib）对 IL-2 和 IFN-α 信号传导的抑制作用是显着的，因为这些细胞因子在产生有效免疫反应中的重要性，特别是在生理相关浓度的索拉非尼观察到信号传导抑制时。虽然在本研究中仅评估了 IL-2、IFN-α 和 IFN-γ 信号传导，但抑制其他依赖于通过 JAK-STAT 途径信号传导的细胞因子的活性是可能的。事实上，探索性研究表明，索拉非尼还抑制了 PBMC 中 IL-21 诱导的 JAK-STAT 信号转导。抑制机制可能涉及对 JAK 活性的影响。最近的观察表明，虽然 JAK1 的总水平不受索拉非尼的影响，但 JAK1 的磷酸化在胶质母细胞瘤细胞系中受到显着抑制。类似地，IL-6 诱导的 STAT3 和 JAK2 磷酸化在神经母细胞瘤细胞系中被索拉非尼抑制。尽管付出了巨大的努力，但我们对索拉非尼处理细胞中 JAK1 活性的分析并未产生抑制 PBMC 中 JAK1 活化的确凿证据。基于上述研究，我们提出索拉非尼通过抑制 JAK 来抑制细胞因子诱导的 JAK-STAT 活化。索拉非尼对其许多靶激酶的作用已被证明是可逆的。然而，虽然一些免疫细胞在暴露于索拉非尼和随后的洗涤后能够恢复细胞因子信号传导，但与未经索拉非尼预处理的免疫细胞相比，这些细胞中的一小部分对细胞因子刺激有反应。这一发现表明，在去除索拉非尼后，该途径的抑制作用不会轻易消除。因此，索拉非尼可能会抑制基线免疫功能，以及基于细胞因子的免疫疗法。相反，已显示 Braf 抑制剂 PLX4032 对 CD8+T 细胞中 STAT1、3、5 和 6 的磷酸化影响最小。

　　最近的研究探索了药理学相关浓度的索拉非尼（Sorafenib）对 T 淋巴细胞和树突状细胞的负面影响，已经显示出对几种途径的影响。已发现索拉非尼可抑制 CD4+和 CD8+T 细胞的增殖。研究表明，与在患者中观察到的水平相当的索拉非尼体外浓度会严重损害正常供体和转移性肾细胞癌和黑色素瘤患者的 T 细胞活化。然而，几项研究也表明，索拉非尼可以激活 T 细胞。例如，亚药理学剂量的索拉非尼选择性地增加 CD4+T 细胞活化和阻断调节性 T 细胞对 HCC 患者的抑制作用。庄等人表明，连续低剂量的索拉非尼通过抑制 STAT3 增强 CD8+ T 细胞的迁移。微信扫描下方二维码了解更多：