MTD2 系小鼠作为致瘤性肝细胞的来源，由我们的实验室维护。只雄性 C57BL/6 小鼠购自 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)，用作制备 HCC 肿瘤模型的受体小鼠。所有涉及动物的实验都得到了密苏里大学动物护理和使用委员会的批准。根据“实验动物护理和使用指南”中概述的标准，对所有小鼠进行人道护理，以此才进行舒尼替尼（Sunitinib）试验。
CCl 4腹腔内 (IP) 给药，然后注射致癌肝细胞以生成 HCC 模型
将玉米油 (Thermo Scientific, Waltham, MA) 中的CCl4溶液 (10% (v/v)) 以 8 mL/kg 体重每周两次 IP 注射到 C57BL/6 小鼠中，持续 4 周。在最后一次注射两周后，小鼠接受了通过脾内 (ISPL) 注射从年轻雄性 MTD2 小鼠中分离的 TAg 转基因肝细胞的接种。简而言之，用异氟醚进行全身麻醉的 C57BL/6 小鼠接受 0.5 cm 的侧腹切口。在暴露的脾脏上，将两个 10 mm 钛夹置于脾脉管系统的上下分支之间，并在两个夹子之间切开脾脏。肝细胞被注入脾脏的下极，并通过门静脉流入肝脏。注射后取出脾下极，缝合切口。
磁共振成像
在哈里·S·杜鲁门纪念退伍军人医院的一个小动物成像中心使用 MRI 进行肿瘤监测。所有 MRI 扫描均在 7.0 Tesla 系统（Bruker Biospin，Billerica，MA）上获得，面内分辨率为 0.1 毫米，切片厚度为 1 毫米。用吸入异氟醚麻醉小鼠，并在整个成像过程中监测生命体征。获得腹部 T2加权 (T2W) MRI 用于肿瘤体积测量。进行扩散加权 (DW) MRI 以检测 RFA 治疗后的肿瘤坏死。
RFA 和舒尼替尼给药
在吸入异氟醚麻醉后，荷瘤小鼠使用配备有 4 mm 心脏消融探头（7F/2.33 mm 直径）的 EPT-1000 XPTM 心脏射频发生器（波士顿科学）接受 RFA。13性能在规定的条件下进行：80°C 的功率输出持续 60 秒。每隔一天通过管饲法将舒尼替尼在 0.2 mL 载体缓冲液中以 20 mg/kg 口服给药于小鼠，持续 2 周。
肝/肿瘤浸润白细胞的分离
用异氟醚麻醉小鼠，然后以4 mL/min的泵速用0.05%胶原酶（Gibco，Gaithersburg，MD）在无Ca2+PBS中进行肝脏/肿瘤灌注。然后收获肝脏或肿瘤，粉碎，并在 GBSS (Sigma, St. Louis, MO) 中的 0.04% 胶原酶中在室温下孵育 20 分钟，在整个消化期间以 240 rpm 的速度摇动。样品通过 250 μm 网孔过滤，用 GBSS（Sigma，St. Louis，MO）洗涤，悬浮在 15 mL GBSS 加 18.45 mL 30% Nycodenz 溶液（Accurate Chemical & Scientific，Westbury，NY）中，最后离心在室温下以1400×g 20 分钟，不带刹车。收集在顶层富集的肝脏或肿瘤浸润性白细胞并用培养基洗涤两次。
用肽离体刺激肝/肿瘤浸润性白细胞
将新鲜分离的脾细胞、肝脏或肿瘤浸润淋巴细胞悬浮并在 RPMI 1640 完全细胞培养基 (Gibco, Gaithersburg, MD) 中于 37°C 在 5% CO2加湿气氛中培养。在存在或不存在阻止细胞因子转运的 3 μg/mL Brefeldin A (Biolegend, San Diego, CA) 的情况下，用 1 μM 剂量的对照或肿瘤特异性抗原表位肽刺激细胞 5 小时。
肿瘤溶解对脾白细胞的体外刺激
将新鲜分离的脾淋巴细胞悬浮在 RPMI 1640 完全培养基 (Gibco) 中，接种在预涂有 1 μg/mL 抗 CD3 的 96 孔板中，并在 5% CO2加湿气氛中于 37°C 培养。在存在或不存在重组 HGF 蛋白 (10 μg/mL) (Bio Legend, San Diego, CA) 或中和的抗 HGF 抗体 (10 μg /mL) (Sino Biological, Beijing, China) 72 小时，然后收获用于以下研究。更多舒尼替尼详情可咨询下方微信。
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