索拉非尼(Sorafenib)可诱导肝癌细胞中应激颗粒的形成

　　应激颗粒 (SG) 是在已知抑制翻译起始的应激条件下形成的细胞质 RNA 多聚体。在大多数报告的压力情况下，SGs 的形成与细胞从压力和存活中恢复有关。在源自癌症的细胞中，SGs 的形成被证明可以促进对蛋白酶体抑制剂或用作化学治疗剂的 5-氟尿嘧啶的抗性。尽管有这些研究，但化疗药物对 SGs 的诱导导致癌细胞耐药的研究仍未得到充分研究。在这里，我们将索拉非尼（Sorafenib）鉴定为一种有效的 SG 化疗诱导剂。索拉非尼处理的肝癌细胞中 SGs 的形成与翻译起始的抑制相关；这两个事件都需要翻译起始因子 eIF2α 的磷酸化。对索拉非尼诱导的 SGs 机制的进一步表征表明，PERK 是负责 SGs 形成的主要 eIF2α 激酶。耗竭实验支持 PERK-eIF2α-SGs 通路在肝癌细胞对索拉非尼耐药中的意义。这项研究还表明 SGs 和磷酸化 eIF2α 之间存在意想不到的复杂调节平衡，其中 SGs 抑制磷酸化 eIF2α 下游 ATF4 细胞死亡途径的激活。

　　在这里，我们将索拉非尼（Sorafenib）鉴定为 HCC 细胞中 SGs 的有效诱导剂。虽然 SGs 的形成被证明可以抑制细胞死亡，但它们通过导致癌细胞抵抗的化学治疗药物的诱导仍然没有得到充分研究。到目前为止，已经描述了两种化疗药物，即蛋白酶体抑制剂硼替佐米（FDA 批准用于治疗骨髓瘤）和 5-氟尿嘧啶（用于治疗头、颈、乳腺癌和结直肠癌）诱导 SGs 。在这两种情况下，SGs 的诱导都需要 eIF2α 的磷酸化。硼替佐米通过激活 HRI 诱导 eIF2α 磷酸化，而 5-氟尿嘧啶通过激活 PKR 触发这种修饰。在这里，我们将 PERK 鉴定为在用索拉非尼治疗 HCC 时诱导 SGs 所需的关键 eIF2α-磷酸化激酶。该研究还揭示了 SGs 和 P-eIF2α 之间可能存在复杂的调节平衡，其中 SGs 控制 P-eIF2α-下游 ATF4 应激死亡途径的激活。PERK-eIF2α-SGs 对 HCC 索拉非尼耐药的影响进行了讨论。

　　据报道，索拉非尼（Sorafenib）对 eIF2α 磷酸化的影响结果相互矛盾。最初表明，用索拉非尼治疗人类白血病细胞会诱导 eIF2α 的磷酸化，这一事件归因于 ER 应激的诱导。然而，最近的研究报告称，用索拉非尼治疗人类尿路上皮细胞系会抑制由 H2O2或多柔比星诱导的 eIF2α 磷酸化。虽然这些相反结果的起源尚不清楚，但它可能表明索拉非尼的细胞类型或组织类型特异性作用。我们发现索拉非尼对 HCC 的治疗有效诱导 eIF2α 磷酸化。eIF2α 的这种磷酸化很可能是在索拉非尼治疗的 HCC 中观察到的翻译起始抑制的原因。然而，我们的结果表明，索拉非尼抑制翻译起始，这是最有希望的化疗靶点之一，进一步证实该药物是一种相关的化疗药物。然而，索拉非尼介导的翻译起始抑制是通过 eIF2α 的磷酸化发生的。一种已知通过诱导 SGs 促进细胞存活的修饰。

　　一些证据支持 PERK-eIF2α 磷酸化在触发索拉非尼（Sorafenib）治疗的 HCC 中 SGs 形成中的作用。首先，我们发现索拉非尼处理在 WT eIF2α 成纤维细胞中诱导 SGs，但在 eIF2αS51A 中不诱导。其中 eIF2α Ser51 已突变为 Ala。其次，用索拉非尼处理的 HCC 中 SGs 的形成与 eIF2α 的磷酸化相关，这在 SGs 形成 Hep3B 中显着高于在 SGs 缺陷型 Huh-7 中。第三，耗竭实验将 PERK 鉴定为主要的 eIF2α 磷酸化激酶，其激活驱动索拉非尼治疗的 HCC 中的 SGs 诱导。我们使用 PERK 的特定药物抑制剂以及在缺乏这种激酶的 MEF 细胞中进一步证实了这些结果。索拉非尼介导的 HCC 中 PERK 激活可能是由于 ER 应激的诱导，这是 PERK 的主要应激激活剂。这也与 Rahmani 等人的研究一致，该研究报告了在索拉非尼处理的人类白血病 (U937) 细胞中诱导 ER 应激和 PERK 激活。然而，尚不清楚 U937 中索拉非尼诱导的 PERK 激活是否足以触发 SGs 形成。

　　我们对 PERK 在 HCC 中诱导 eIF2α 磷酸化和 SGs 形成的作用的证明并不排除其他 eIF2α 激酶的微妙贡献。在这方面，我们注意到，在 PERK 耗尽的 Hep3B 中，索拉非尼（Sorafenib）诱导的 eIF2α 磷酸化和 SGs 形成均减少但未完全阻断。之前有报道称，索拉非尼会诱导氧化应激，这是 eIF2α 激酶 HRI 的主要激活剂。我们的消耗实验使得 HRI 在 eIF2α 的残留磷酸化和相关 SGs 形成中的可能贡献不太可能，这在 PERK 消耗的 HCC 中都被检测到，在给予索拉非尼后。PKR 或 GCN2 是否有助于 eIF2α 的磷酸化和 SGs 的形成，在用索拉非尼治疗后仍然发生在 PERK 耗尽的 HCC 中仍然不清楚。尽管如此，我们的结果清楚地将 PERK 确定为索拉非尼治疗的 HCC 中 SGs 形成所需的主要 eIF2α 激酶。

　　除了少数例外，SGs 的形成通常与细胞对压力的细胞毒性作用的抵抗力有关。我们的数据支持 SGs 在 HCC 对索拉非尼耐药中的可能贡献。我们发现，与形成 SGs 的 Hep3B 相比，索拉非尼（Sorafenib）通过在 SGs 缺陷的 Huh-7 中通过细胞凋亡诱导显着的细胞死亡。证实了以前的研究。与缺乏 SGs 的 Huh-7 相比，对索拉非尼介导的 SGs 形成的 Hep3B 细胞凋亡的相对抗性与 SGs 公认的抗细胞凋亡作用一致。SGs 缺陷的 Huh-7 中的大量细胞凋亡诱导。然而，与通过 Hep3B 中的 PERK 消耗部分破坏 SG 获得的结果形成对比（数据未显示）。PERK 消耗未能进一步使 Hep3B 对索拉非尼诱导的细胞凋亡敏感可能是由于 Hep3B 中仍形成残留的抗细胞凋亡 SGs。尽管如此，我们始终如一地测量了 PERK 消耗对索拉非尼治疗的 HCC 的克隆存活率的显着负面影响。这种明显的与细胞凋亡无关的存活丧失增加了 PERK 可能拮抗索拉非尼诱导的非细胞凋亡形式的细胞死亡的可能性；一个需要额外研究进行验证的假设。总之，我们的数据表明，HCC 对索拉非尼（Sorafenib）的耐药性需要 PERK 活性，部分原因是触发 SGs 的形成。

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