依维莫司(Afinitor)诱导芳香酶抑制剂耐药的乳腺癌细胞自噬

　　mTOR 对芳香酶抑制剂 (AI) 耐药性乳腺癌的抑制作用目前正在临床评估中。依维莫司（Afinitor）作为单独药物的疗效有限，但预计将成为抗 AI 乳腺癌联合治疗的一部分。本研究旨在研究依维莫司在 AI 耐药乳腺癌细胞中的抗增殖和耐药机制。

　　方法：

　　在这项研究中，我们利用了两种 AI 抗性乳腺癌细胞系 MCF-7:5C 和 MCF-7:2A，它们是从长期缺乏雌激素后雌激素受体阳性 (ER+) MCF-7 乳腺癌细胞克隆衍生而来的。细胞活力测定、集落形成测定、细胞周期分析和软琼脂贴壁依赖性生长测定用于确定依维莫司抑制 MCF-7、MCF-7:5C、MCF-7 增殖和肿瘤形成潜力的功效： 2A 和 MCF10A 细胞。共聚焦显微镜和透射电子显微镜用于评估 LC3-II 的产生和自噬体的形成，而 ERE-荧光素酶报告基因、蛋白质印迹和 RT-PCR 分析用于评估 ER 表达和转录活性。

　　结果：

　　依维莫司抑制 MCF-7:5C 和 MCF-7:2A 细胞增殖的效率与亲代 MCF-7 乳腺癌细胞相当。依维莫司的抑制作用是由于细胞周期蛋白 D1 和 p21 下调导致 G1 期停滞。除了 ER 伴侣蛋白、热休克蛋白 90 蛋白 (HSP90) 外，依维莫司还显着降低了雌激素受体 (ER) 的表达（mRNA 和蛋白质）和转录活性。依维莫司恢复了 MCF-7:5C 细胞中 4-羟基三苯氧胺 (4OHT) 的敏感性，并增强了 MCF-7 和 MCF-7:2A 细胞中的 4OHT 敏感性。值得注意的是，我们发现自噬是 MCF-7 乳腺癌细胞系中依维莫司不敏感的一种方法。

　　结论：

　　这项研究提供了对依维莫司（Afinitor）作用机制的进一步了解，该机制可用于增强 mTOR 抑制剂作为 AI 抗性乳腺癌联合治疗的一部分的效用。

　　本研究旨在为依维莫司（Afinitor）对 AI 抗性 MCF-7:5C 和 MCF-7:2A 乳腺癌细胞以及 AI 敏感性 MCF-7 细胞的抗增殖作用提供机制见解。我们发现依维莫司对所有三种乳腺癌细胞系同样有效。抗增殖机制包括下调 ER 表达和转录活性，可能是通过抑制 HSP90。我们还证明依维莫司在所有三种细胞系中都增强了 4OHT 敏感性。依维莫司治疗显着诱导自噬，这与 HSP70 和 HSP27 表达的下调有关。此外，我们证实依维莫司抑制 PI3K/Akt/mTOR 通路的激活，导致细胞周期蛋白 D1 和 p21 表达下调，从而诱导 G1 期阻滞。

　　与其他 luminal A 乳腺癌细胞系相比，MCF-7 细胞及其衍生物对依维莫司（Afinitor）更具抗性。我们的研究与这一观察结果一致，因为 MCF-7、MCF-7:5C 和 MCF-7:2A 细胞的总抑制不超过 60%，使它们适合模拟对依维莫司不高度敏感的患者群体.此外，我们的 IC50值与在研究 MCF-7 细胞系时频繁使用 20 nM 依维莫司一致。MCF-7:5C 细胞的不敏感性增强可能是由于 c-myc 的表达增加，这被认为在 ER+ 乳腺癌中赋予了一些抗性 。MCF-7:2A 细胞对依维莫司的敏感性略有增强，可能与 PTEN 水平相对较低有关。应该注意的是，MCF-7 和 MCF-7:2A 细胞是孕激素受体阳性 (PR+)，而 MCF-7:5C 细胞是 PR 阴性 (PR-)，它们过表达干扰素刺激基因。这些差异似乎并不介导依维莫司敏感性的任何差异，表明这些细胞系的 MCF-7 背景是反应的最突出决定因素。

　　在内分泌抗性细胞和内分泌抗性肿瘤中都观察到了升高的 ER 表达和信号传导。依维莫司（Afinitor）在 MCF-7/LTED 细胞中降低 ER 转录活性和磷酸化 ER (p-ER) 表达的能力之前已有报道，但未在野生型 MCF-7 细胞中进行评估。在我们的研究中，我们发现 ER 转录活性的抑制是由于所有细胞模型中总 ER 表达的显着下调。MCF-7:5C 和 MCF-7:2A 细胞是在无雌激素培养基中选择的克隆，通过上调 ER 表达和不依赖配体的 ER 信号传导保留了 ER 转录活性。相比之下，MCF-7/LTED 细胞是对雌激素产生超敏反应的混合细胞群。此外，Martin 及其同事的研究是在急性胰岛素剥夺后进行的，这可能有助于提高对依维莫司的敏感性以及对研究中 p-ER 和 p-Akt 表达的影响。依维莫司作为单独药物的临床疗效被认为受到通过 mTORC2 引起的 Akt 磷酸化补偿性增加的限制。我们没有观察到我们细胞系中 Akt 磷酸化的这种反射性增加。我们的结果表明，依维莫司作为单一药物，通过同时抑制某些系统中的生长因子和 ER 信号传导，能够以类似于联合治疗的方式发挥作用。据我们所知，以前没有报道过依维莫司对总 ER 表达的下调。

　　总体而言，该研究表明依维莫司（Afinitor）通过下调 ER 表达抑制 AI 抗性乳腺癌细胞的增殖，并且诱导自噬是依维莫司不敏感的一种方法。我们发现依维莫司对我们的 AI 敏感（MCF-7）和 AI 抗性（MCF-7:5C 和 MCF-7:2A）模型的增殖具有相似的影响，表明这些细胞的 MCF-7 背景行覆盖可能影响依维莫司敏感性的任何其他差异。无论 PR 状态、PTEN 表达、1 型干扰素信号传导和 4OHT 敏感性如何，均观察到增殖抑制，支持依维莫司作为多种 AI 耐药患者联合治疗的一部分的结论一个选项。微信扫描下方二维码了解更多：