帕纳替尼(Ponatinib)抑制与FGFR1异常相关的髓系恶性肿瘤的发展

　　与 FGFR1 异常相关的髓系和淋巴系恶性肿瘤的特征在于组成型激活的 FGFR1 激酶和快速转化为急性髓系白血病和淋巴母细胞淋巴瘤。分子靶向治疗尚未广泛用于 SCLL。Ponatinib (帕纳替尼) 有效抑制天然和突变 BCR-ABL，也靶向成纤维细胞生长因子受体 (FGFR) 家族。使用稳定转化六种不同 FGFR1 融合基因的鼠 BaF3 细胞，以及表达活化嵌合 FGFR1 的人 KG1 细胞和五种新建立的鼠 SCLL 细胞系，我们表明帕纳替尼(< 50 nM) 可以有效抑制融合激酶的磷酸化和它们的下游效应器，例如 PLCγ、Stat5 和 Src。帕纳替尼还显着延长了移植了不同 SCLL 细胞系的小鼠的存活率。每天以 30 mg/kg 给药的 Ponatinib 也显着延迟甚至阻止了异种移植小鼠中 KG1 细胞的肿瘤发生。此外，我们证明帕纳替尼可特异性抑制由嵌合 FGFR1 融合激酶转化的正常人 CD34+ 祖细胞的细胞生长和克隆形成。

　　总体而言，我们的数据提供了令人信服的证据，表明使用帕纳替尼对 FGFR1 融合激酶的药理学抑制可能对 SCLL 患者以及其他与 FGFR1 活性失调相关的人类疾病有益。我们证明帕纳替尼特异性抑制由嵌合 FGFR1 融合激酶转化的正常人 CD34+ 祖细胞的细胞生长和克隆形成。

　　迄今为止报告的所有患有 MLNAF 的患者都携带嵌合 FGFR1 激酶，这表明该激酶的组成型激活是主要的起始事件，尽管似乎疾病发展需要其他遗传事件。然而，嵌合激酶的持续功能似乎是维持细胞活力所必需的，因为用各种药物使其功能失活会降低细胞存活率。例如，以前的研究表明，PKC412 (midostaurin) 和 TKI258 (dovitinib) 增加了 FGFR1 转化的 BaF3 细胞和人类白血病 KG1 细胞的生长抑制。TKI258也抑制了原代 MLNAF 细胞的增殖.在一名患有晚期疾病的 ZMYM2-FGFR1 患者中，PKC412 治疗诱导了部分反应，但最近的数据表明，该化合物在 500 nM（IC50剂量）下对 FGFR 活性缺乏特异性。尽管有这些对 MLNAF 有效的迹象，但显然需要检查可以更有效地靶向 FGFR1 活性的其他化合物。尽管帕纳替尼是一种口服活性的多靶点激酶抑制剂，最初是为治疗难治性和突变型 BCR-ABL 阳性慢性髓细胞白血病 (CML) 开发的，但对同样下调的激酶谱的分析表明，FGFR 激酶在纳摩尔浓度下被抑制。此外，帕纳替尼在体外有效抑制 KG1 细胞生长。这些观察结果促使我们研究它是否也可以用作治疗 MLNAF 的治疗剂。在人类疾病和 MLNAF 的小鼠模型中，有证据表明，尽管 MPD 是该综合征的常见成分，但发生的特定白血病/淋巴瘤（T 细胞或 B 细胞）在一定程度上取决于特定的表达的个体变异嵌合激酶。一些患者同时出现双系（髓系和淋巴系）肿瘤。因此，这些观察结果表明，针对该综合征中所有变异疾病常见的遗传异常将是最成功的。事实上，我们发现帕纳替尼在体外和体内都能有效地抑制 MLNAF 淋巴细胞和人骨髓 KG1 细胞。这些实验中所需的 Ponatinib 有效剂量比 TKI258 低 5-10 倍，这与 Gozgit 等人的结果一致。在 BaF3 细胞中被设计为表达 4 种 FGFR 中每一种的组成型激活版本。同样，在 MLNAF 的小鼠模型中，帕纳替尼 (20 mg/kg) 也显示出比 PKC412 描述的 100 mg/kg 更有效，这也与我们用 PKC412 处理 ZNF112 细胞的体外实验一致，PKC412 在诱导与帕纳替尼相同水平的细胞生长抑制方面的效果要低 10 倍。总体而言，这些观察结果提供了临床前证据，证明作为 MLNAF 治疗策略的一部分，帕纳替尼可能比其他 FGFR1 抑制剂更有效。

　　尽管帕纳替尼（ponatinib）在体外对 FGFR1 激酶功能有显着影响，但体内治疗显示出有限的成功。在我们实验中使用的 30 mg/Kg 剂量下，计算Ponatinib 在口服给药后 6 小时可达到 561 nM 的平均血浆水平，这是MLNAF 中记录的 IC50值的 10-20 倍体外细胞.尽管如此，只有 20% 的小鼠 MLNAF 异种移植小鼠存活，40% 的异种移植 KG1 细胞小鼠在帕纳替尼治疗后表现出长期存活。应该注意的是，如果治疗时间超过 4 周，这种存活率可能会延长。这些研究清楚地表明，分子靶向单一癌基因/途径可能不足以预防疾病进展，尤其是在使用单一药物长期治疗后经常出现耐药性克隆的情况下。以前的研究表明由 ZMYM2-FGFR1 诱导的白血病/淋巴瘤是寡克隆的，这表明 FGFR1 驱动的白血病发生的发展和进展需要额外的事件，遗传或表观遗传。我们之前证明，ZMYM2-FGFR1 驱动的鼠 T-ALL 需要T 细胞受体 α (Tcra) 基因的一致缺失以及 Notch1的突变激活。用 GSI 治疗这些 T-ALL 显示出一定的疗效。我们还表明，Bcl2的上调和 PI3K 的激活是 MLNAF 中的常见事件，因此靶向这些蛋白质对体外细胞活力有显着影响（数据未显示）。因此，针对所有这些目标的联合药物可能在治疗这种疾病方面取得更大的成功。

　　在我们对 NSG 小鼠进行的体内实验中，我们观察到每天口服 40 mg/kg 帕纳替尼仅在一周后导致所有接受治疗的小鼠体重显着减轻和毛皮皱褶。中断治疗一周后，小鼠恢复，然后我们继续以 30 mg/kg 的剂量给药，采用 4 天开/3 天停药方案，药物似乎耐受性更好。奥黑尔及其同事据报道，尽管 NSG 小鼠似乎更敏感，但帕纳替尼显示出广泛的治疗范围（5-50mg / kg），在 SCID 和裸鼠模型中均具有良好的耐受性。相反，在异种移植 ZNF112 或 CEP2A 的 Balb/c 小鼠中，我们没有观察到 Ponatinib 治疗 (20 mg/kg) 的副作用。与 SCID（缺乏 T 和 B 细胞）和裸鼠（大大减少的 T 细胞数量）相比，NSG 小鼠的这种敏感性增加可能是由于它们的极端免疫缺陷（成熟 T、B 和自然杀伤细胞的缺失）。

　　总之，我们提供了令人信服的证据，证明帕纳替尼（ponatinib）可以有效抑制各种 FGFR1 融合激酶及其下游效应子的磷酸化水平，从而导致细胞生长抑制和死亡。与这些体外研究一致，短期暴露于帕纳替尼可以显着延长体内异种移植不同嵌合 FGFR1 驱动的白血病小鼠的存活率，以及用嵌合 FGFR1 激酶转化的人 CD34+ 祖细胞的细胞生长和集落形成功效。这些结果提供了一个原理证明，即用新型 FGFR1 抑制剂帕纳替尼（ponatinib）分子靶向表达嵌合 FGFR1 激酶的细胞可能是治疗 MLNAF 患者的潜在成功方法，无论是单独使用还是与其他药物联合使用，例如靶向 Src 的药物或 Notch1 信号通路。

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