如何增强奈拉替尼(neratinib)的活性

　　NSCLC 肿瘤对阿法替尼产生耐药性的患者目前几乎没有有效的治疗选择来延长其生存期。阿法替尼耐药 NSCLC 细胞对临床相关浓度的不可逆 pan-HER 抑制剂奈拉替尼（neratinib）敏感，但对第一代 ERBB1/2/4 抑制剂拉帕替尼不敏感。在多个阿法替尼耐药的 NSCLC 克隆中，HDAC 抑制剂降低了 ERBB1/3/4 的表达，但激活了 c-SRC，这导致更高的 ERBB1/3 磷酸化总水平。Neratinib 也迅速降低了表达ERBB1/2/3/4、c-MET 和突变 K-/N-RAS 的；K-RAS 与磷酸化的 ATG13 和囊泡中的组织蛋白酶 B 共定位。细胞联合暴露于 [neratinib + HDAC 抑制剂] 导致 mTORC1 和 mTORC2 失活，增强自噬体和随后的自溶酶体形成，并导致细胞死亡的加性大于加性诱导。敲除 Beclin1 或 ATG5 可防止 HDAC 抑制剂或奈拉替尼降低 ERBB1/3/4 和 K-/N-RAS 表达并降低 [neratinib + HDAC 抑制剂] 的致死率。Neratinib 和 HDAC 抑制剂通过自噬降低了多种 HDAC 蛋白的表达，这导致 PD-L1、PD-L2 和鸟氨酸脱羧酶的表达降低，以及 I 类 MHCA 的表达增加。体内，奈拉替尼和 HDAC 抑制剂相互作用以抑制 4T1 乳腺肿瘤的生长，抗 PD-1 抗体增强了这种作用。我们的数据支持这样的前提，即奈拉替尼可以通过 HDAC 抑制剂增强致死率，奈拉替尼可能是阿法替尼耐药 NSCLC 的有用治疗工具，并且 [奈拉替尼 + HDAC 抑制剂] 暴露促进抗肿瘤免疫反应。

　　本研究旨在进一步研究奈拉替尼（neratinib）单独或与其他药物联合使用的活性。本手稿中的主要发现是，临床相关浓度的奈拉替尼可杀死阿法替尼耐药的 NSCLC 细胞，而 HDAC 抑制剂可以增强这种杀伤力。此外，neratinib / HDAC 抑制剂联合疗法增强了肿瘤细胞的免疫原性特征，这可能表明剩余肿瘤细胞对免疫治疗药物的敏感性，例如免疫检查点抑制。

　　除了这些研究的主要目标外，我们还证实奈拉替尼（neratinib）与阿法替尼或拉帕替尼一样有效地增强了先前建立的[培美曲塞 + 索拉非尼]、[瑞戈非尼 + 西地那非]、[奈拉替尼 + 达沙替尼]药物组合的致死率和[鲁索替尼+奈拉替尼]。这些组合还改变了免疫调节蛋白的表达，因此可以预测这些药物组合可以与检查点免疫治疗抗体产生协同作用。基于先前的研究，奈拉替尼增强[培美曲塞+索拉非尼]体内抗肿瘤功效的能力趋于大于阿法替尼的能力。我们目前正在制定一项方案，以在 2018 年联合 [培美曲塞 + 索拉非尼 + 奈拉替尼] 进行三药全实体瘤 I 期试验。

　　我们研究的一个意外观察结果是，奈拉替尼（neratinib）通过自噬依赖性过程导致 ERBB1、ERBB3、ERBB4 和 c-MET 的分解。众所周知，ERBB1 配体 EGF 和 TGFα 不同地调节受体的信号传导、内化和再循环。EGF 在酸性内体环境中仍然附着在 ERBB1 上，这导致最初的延长信号反应，但随后导致受体降解。另一方面，TGFα从内化的ERBB1中解离，导致受体失活和受体再循环到细胞表面。这些过程还可能导致细胞对 EGF 暴露的不同生物反应。用 0.1-0.5 ng/ml EGF 处理的鳞状 A431 癌细胞增殖；用 1-2 ng/ml EGF 生长停滞处理的细胞；用 5-10 ng/ml EGF 处理的细胞在 24 小时内发生凋亡。奈拉替尼诱导受体酪氨酸激酶内化和降解的确切机制目前尚不清楚。ERBB1/2/4 特异性抑制剂降低了不受奈拉替尼催化抑制的受体 c-MET 和不结合 ATP 的激酶死亡受体 ERBB3 的表达，这表明 ERBB1/2/ 的化学修饰4必须触发质膜中的地震事件，其中不仅ERBB家族受体被内化，而且“同伴”受体酪氨酸激酶也被引导至溶酶体降解。

　　与阻断 ERBB1/2/4 的抑制剂相比，ERBB1 特异性抑制剂在临床上被证明效果较差的一个原因是 ERBB 受体家族可以相互异二聚化。吉非替尼和厄洛替尼都不能阻止 ERBB2 反式磷酸化 ERBB3，从而可能促进进化生存途径。亲本和阿法替尼耐药 H1975 细胞表达低水平的 ERBB2，在阿法替尼耐药克隆中下降。在我们的阿法替尼耐药克隆中，我们已经认识到 c-SRC 被激活，并且在这些克隆中，虽然我们发现 c-SRC 与 ERBB1 的定位并未因阿法替尼耐药而改变，但 c-SRC 靶向 ERBB1 和 ERBB3 成为共-本地化。对于阿法替尼耐药克隆，通过 ERBB3 发出信号的存活作用已经确定，在阿法替尼耐药克隆中，我们发现丙戊酸盐进一步激活 c-SRC 增加了 PI3K p110α/β 与 ERBB3 的共定位。其他人已经表明，c-SRC 还可以促进 c-MET 的激活，共同证明我们的系统认为，在阿法替尼耐药 H1975 克隆中 c-SRC 激活的进化是主要的进化生存事件。c-SRC 在阿法替尼耐药克隆中被激活的分子机制目前尚不清楚。

　　我们实验室最近的研究表明，诱导自噬体和自溶酶体形成的药物组合，例如 [培美曲塞 + 西地那非] 或 [帕唑帕尼 + HDAC 抑制剂]，可以降低 HDAC 的表达，特别是 HDAC6 。HDAC6 是一种胞质 HDAC，可调节 HSP90 和 HSP70 的活性，抑制 HDAC6 功能会降低这些促进内质网应激和自噬的蛋白质的伴侣功能。奈拉替尼（neratinib）作为单一药物降低了 HDAC6 的表达并增强了 Beclin1 的表达，丙戊酸盐可以放大这些效果。奈拉替尼还降低了 HDACs2/4/10 的表达，这表明，Neratinib 依赖性的 HDAC10 水平降低将直接影响免疫治疗生物标志物的表达。由本身不是 HDAC 抑制剂的药物引起的肿瘤细胞生物学的 HDAC 依赖性变化将需要超出本文范围的研究。

　　免疫疗法是 NSCLC 中的标准护理方式，现在被批准与培美曲塞和卡铂联合作为一线疗法。表达ERBB1突变活性形式的 NSCLC 患者的一线疗法是 ERBB1 抑制剂（厄洛替尼、吉非替尼、阿法替尼）。在接下来的 6-18 个月内，NSCLC 肿瘤会进化，从而对激酶抑制药物产生抗药性。从体外研究可知，ERBB1 抑制剂可降低 NSCLC 细胞中免疫治疗生物标志物（如 PD-L1）的表达，而激酶抑制剂耐药患者的肿瘤表达低水平的 PD-L1 和 PD-L2 。在 NSCLC 中，低水平的免疫治疗生物标志物与抗 PD-1 和抗 CTLA4 抑制性抗体的抗肿瘤反应差有关。我们的研究结果表明，奈拉替尼（neratinib） + valproate不仅可以杀死对阿法替尼耐药的肿瘤细胞，而且还可以使它们对促进免疫肿瘤细胞破坏的检查点抑制性抗体敏感。只有对阿法替尼耐药患者的临床研究才能证明或反驳目前的研究结果是否会转化为更好的结果和生存率。

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