尼达尼布(Nintedanib)在各种体外试验中干扰必需的纤维化过程

　　特发性肺纤维化 (IPF) 是一种进行性和最终致命的疾病，其特征是肺实质纤维化和肺功能丧失。虽然与 IPF 相关的致病途径尚未完全阐明，但认为 IPF 是由反复肺泡上皮细胞损伤和修复失调引起的，其中肺成纤维细胞不受控制地增殖，成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，过度沉积细胞外基质(ECM) 蛋白质在间隙空间中。许多促纤维化介质，包括血小板衍生生长因子 (PDGF)、成纤维细胞生长因子 (FGF) 和转化生长因子-β，被认为在 IPF 的发病机制中起重要作用。尼达尼布（Nintedanib）是受体酪氨酸激酶 PDGF 受体的有效小分子抑制剂，FGF受体和血管内皮生长因子受体。数据来自体外研究表明，尼达尼布会干扰纤维化中活跃的过程，如成纤维细胞增殖、迁移和分化，以及 ECM 的分泌。此外，尼达尼布在肺纤维化动物模型中显示出一致的抗纤维化和抗炎活性。这些数据为尼达尼布对 IPF 患者的临床疗效提供了强有力的理由，最近在 III 期临床试验中得到了证明。

　　尼达尼布（Nintedanib）在各种体外试验和体内模型中干扰必需的纤维化过程

　　对成纤维细胞增殖和迁移的影响

　　尼达尼布的抑制活性在来自 IPF 患者 (IPF-HLF) 和对照供体 (N-HLF) 的原代人肺成纤维细胞的细胞水平上得到证实。尼达尼布抑制 N-HLF 中 PDGF-BB 刺激的 PDGFRα 和 β 自磷酸化，IC50值分别为 22 和 39 nmol·L-1，在同一组实验中抑制 PDGF-BB 刺激的增殖，IC50为 64 nmol·L-1。在 IPF-HLF 中，PDGF-BB、FGF-2 和 VEGF 引起显着的促增殖作用，而尼达尼布可显着逆转该作用。在 N-HLF 中，甚至更低浓度的尼达尼布也能显着拮抗生长因子诱导的促增殖作用。与 N-HLF 相比，IPF-HLF 对所有三种生长因子均表现出更强的迁移反应。在 IPF-HLF 和 N-HLF 中，尼达尼布显着拮抗生长因子诱导的细胞增殖。在延时显微镜研究中，尼达尼布以浓度依赖性方式抑制 PDGF 和 FGF 刺激的成纤维细胞运动。Nintedanib 减弱 PDGF 刺激的 IPF-HLF 和 N-HLF 的运动性，IC50值为 28 和 19 nmol·L-1和 FGF 刺激的运动性，IC50值分别为 226 和 86 nmol·L-1。

　　对 EMT 的影响

　　尽管上皮细胞能够分化为间充质细胞，但 EMT 在患者诊断时和 IPF 进一步进展期间的重要性仍存在争议。≥300 nmol·L-1浓度的尼达尼布不改变来自无 IPF 供体的原代肺泡 II 型上皮细胞的形态，并且对 TGF-β 诱导的 (2 ng·mL-1) EMT没有抑制活性。在线补充材料部分 B)。

　　对成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响

　　尼达尼布（Nintedanib）抑制 TGF-β 诱导的 (10 ng·mL-1) 成纤维细胞向 IPF 患者的原代人肺成纤维细胞转化成肌成纤维细胞，如通过作为肌成纤维细胞分化标志物的 α-平滑肌肌动蛋白 mRNA 表达所确定的，估计 IC50值 144 nmol·L-1。

　　对 ECM 组件的影响

　　尼达尼布减少了 IPF 患者原代人肺成纤维细胞 TGF-β 刺激的胶原蛋白分泌和沉积，这些细胞培养了 48 小时。尼达尼布还降低了分泌的 TIMP-2 水平并诱导前基质金属蛋白酶 (MMP)-2 的分泌。降低的 TIMP-2 水平以及增加的 pro-MMP-2 可能有助于减少胶原蛋白。尼达尼布抑制成纤维细胞/肌成纤维细胞增殖也可能对 ECM 分泌和沉积产生间接抑制作用。

　　对细胞凋亡的影响

　　据报道，在 IPF 患者中，肺成纤维细胞/肌成纤维细胞对凋亡刺激的抵抗力升高，从而阻止了纤维化的消退。尼达尼布是否能够诱导人肺成纤维细胞凋亡目前尚不清楚。尼达尼布诱导人脐血管内皮细胞 (HUVEC)、人脐动脉平滑肌细胞 (HUASMC) 和牛视网膜周细胞凋亡。裂解的 caspase-3 用作细胞凋亡的指示剂。尼达尼布以浓度依赖性方式诱导用 VEGF 或 FGF-2 刺激的 HUVEC、用 PDGF-BB 或 FGF-2 刺激的 HUASMC 以及用 PDGF-BB 和 FGF-2 刺激的周细胞凋亡 。

　　尼达尼布（Nintedanib）的抗血管生成活性

　　抗血管生成活性在 IPF 治疗中的潜在影响已在文献中讨论过，但尚未阐明。实验证据证实，抑制 VEGF、PDGF 和 FGF 信号通路可减少肺中的肿瘤血管生成。尼达尼布抑制了有助于肺血管生成的三种细胞类型的增殖：内皮细胞、周细胞和平滑肌细胞。尼达尼布抑制 VEGF 刺激的 HUVEC、PDGF-BB 刺激的 HUASMC 和 PDGF-BB 刺激的牛视网膜周细胞的增殖，IC50值分别为9、69 和 79 nmol·L-1。此外，尼达尼布降低了肿瘤微血管密度，并在小鼠异种移植肿瘤的动物模型中证明了临床前抗血管生成功效 。综上所述，实验证据支持尼达尼布具有抗血管生成功效；然而，这是否会增加其在 IPF 中的抗纤维化活性仍有待阐明。

　　简而言之，PDGF 诱导的 PDGFR 磷酸化作为受体激活标记是通过来自小鼠肺组织的匀浆的蛋白质印迹确定的。在接受单次气管内剂量的 PDGF 之前，用不同剂量的尼达尼布治疗动物。尼达尼布对 PDGFR 磷酸化的抑制活性用于建立尼达尼布在小鼠体内的药代动力学/药效学相关性。

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