达拉非尼(dabrafenib)通过如何抑制BRAF-WT癌症的生长

　　尽管 BRAF 抑制剂达拉非尼（dabrafenib）和威罗菲尼（vemurafenib）均已被证明对BRAF突变黑色素瘤有效，但它们的作用机制似乎存在差异。在这里，我们表明 dabrafenib 在抑制NRAS突变体和KRAS 突变体癌细胞系的生长方面比威罗非尼更有效。使用基于质谱的化学蛋白质组学，我们将 NEK9 和 CDK16 确定为 dabrafenib 的独特靶标。NEK9 和 CDK16 在晚期黑色素瘤标本中均高表达，两种蛋白质的高表达与较差的总体存活率相关。NEK9 在NRAS和KRAS生长中的作用siRNA 研究提出了突变细胞系，其中沉默与增殖减少、细胞周期停滞与 p21 表达增加、磷酸化 CHK1 抑制、CDK4 表达减少和衰老反应的启动有关。CDK4 的抑制而不是 CHK1 的抑制概括了 NEK9 沉默的影响，表明这可能是生长抑制的机制。我们接下来将注意力转向 CDK16，发现它的敲低抑制了 Rb 蛋白在 S780 处的磷酸化并增加了 p27 的表达。这两种效应都在NRAS-和KRAS- 中进行了表型复制。达拉非尼的突变癌细胞，但不是威罗非尼。NEK9 和 CDK16 的联合沉默与增强的黑色素瘤细胞增殖抑制有关。总之，我们已将 dabrafenib 鉴定为 NEK9 和 CDK16 的有效抑制剂，我们的研究表明，这些激酶的抑制可能对没有BRAF突变的癌症具有活性。

　　Vemurafenib 和达拉非尼在临床实践中广泛用于治疗BRAF突变型黑色素瘤。尽管它们的功效相似，但在副作用方面观察到了显着差异。这导致我们假设，与威罗非尼相比，达拉非尼可能抑制一系列不同的激酶靶标，而威罗非尼可能对BRAF具有活性野生型肿瘤。与此一致，我们的初步研究表明，在抑制NRAS和KRAS突变癌细胞系的生长方面，达拉非尼比威罗非尼更有效。

　　为了更好地了解达拉非尼（dabrafenib）和 vemurafenib 之间的影响差异，我们进行了化学蛋白质组学筛选以定义独特的脱靶激酶谱。化学蛋白质组学是一种创新方法，它使用感兴趣的药物“下拉”相互作用的蛋白质和激酶，然后使用质谱法对其进行鉴定。它具有不偏不倚和高度敏感的优点，以及捕捉药物对蛋白质-蛋白质复合物的影响——这是通过体外激酶测定无法实现的。先前的研究使用细胞类型不可知的体外激酶测定，已经确定了威罗非尼的其他潜在靶标（CRAF、BRAF、SRMS、MAPK4K5、FGR：IC50 均 <100 n米）和dabrafenib（BRAF，CRAF，SIK2，ALK5：IC50所有<100 n中米）。在这里测试的三种药物中，曲美替尼的靶点谱最窄，基本上只与 MAP2K 激酶家族的成员相互作用。与 ATP 竞争性 BRAF 抑制剂相比，这可能反映了变构 MEK 抑制剂的高度特异性。我们的化学蛋白质组学分析确定了一系列以前未知的达拉非尼靶标，包括 CAMK1α、CDK16 和 NEK9。NEK9 和 CDK16 被选择用于进一步研究，基于它们在体外被达拉非尼的有效抑制作用激酶测定，以及初步的 siRNA 实验，其中它们的沉默抑制了NRAS突变黑色素瘤细胞的生长。

　　最近的研究表明，缺乏 p53 功能的癌细胞的增殖依赖于 NEK9。分析我们的NRAS-和KRAS-的遗传谱突变细胞系显示其中许多含有失活的 p53 突变。为了进一步确定达拉非尼治疗后 NEK9 抑制的 p53 依赖性，我们评估了两种 BRAF 抑制剂对同基因 p53+/+ 和 p53-/- HCT116 细胞的影响，发现达拉非尼选择性抑制 pCHK1 并增加细胞中 p21 的表达是 p53 无效的。与 p53+/+ 相比，在 p53-/- HCT116 细胞中观察到的达拉非尼增强的生长抑制作用进一步表明 NEK9 在缺乏 p53 功能的癌细胞生长中的作用。尽管我们对黑色素瘤 TCGA 数据库的分析显示 NEK9 高水平表达与较差的总体生存率相关，但我们无法将其与 p53 突变状态相关联。

　　由于我们的数据表明达拉非尼（dabrafenib）是 NEK9 的强效抑制剂，它也可能击中其他靶点，因此我们接下来将注意力转向 CDK16（或 PCTAIRE1）。多项研究已证明 CDK16 在癌症进展中的作用，前列腺、乳腺癌和宫颈癌细胞系显示出相对于正常细胞的表达增加。在癌细胞中，CDK16 通过与 p27KIP1 的相互作用参与细胞周期调控，在 S10 催化 p27 磷酸化，导致其降解。CDK16 也被建议作为BRAF的治疗靶点与良性痣相比，在黑色素瘤转移中报告的蛋白质表达增加的突变黑色素瘤。通过 shRNA 沉默 CDK16 可在体外和体内抑制BRAF突变黑色素瘤细胞系的生长。我们证实了这些发现，并通过对 TCGA 黑色素瘤数据集的分析表明，CDK16 的高表达与较短的总生存期相关。BRAF和NRAS中 CDK16 的沉默突变黑色素瘤细胞系导致与 p27 表达相关的细胞周期停滞和 S780 处 RB 蛋白磷酸化降低。在这些情况下，通过达拉非尼而不是 vemurafenib 治疗概括了RAS突变癌细胞系中CDK16 沉默的影响。

　　我们首次表明达拉非尼（dabrafenib）有效抑制不受威罗非尼影响的激酶，包括 NEK9 和 CDK16。NEK9 和 CDK16 抑制可能有助于达拉非尼的活性，这可能表明该药物在其他非BRAF突变癌症中的效用。微信扫描下方二维码了解更多：