泰菲乐/达拉非尼明显减轻对乙酰氨基酚引起的肝损伤

　　受体相互作用蛋白 (RIP)3 是坏死性凋亡的关键调节因子，已被证明与多种疾病有关，这表明其抑制剂在临床上很有前景。然而，迄今为止报道的 RIP3 抑制剂很少。B-RafV600E抑制剂是转移性黑色素瘤治疗的重要抗癌药物。在这项研究中，我们发现 6 种 B-Raf 抑制剂可以在体外抑制 RIP3 酶活性.其中，达拉非尼/泰菲乐对 RIP3 表现出最有效的抑制作用，这是通过其与酶的 ATP 竞争性结合来实现的。达拉非尼对 RIP3 的抑制作用优于对 RIP1、RIP2 和 RIP5 的选择性抑制。此外，只有达拉非尼从 RIP3 介导的坏死性凋亡诱导的组合，即肿瘤坏死因子 (TNF)α诱导的坏死性凋亡中拯救了细胞，TNF相关的凋亡诱导配体或Fas配体加上Smac模拟物和半胱天冬酶抑制剂z-VAD。达拉非尼降低了 RIP3 介导的混合谱系激酶域样蛋白 (MLKL) 的 Ser358 磷酸化，并破坏了 RIP3 和 MLKL 之间的相互作用。值得注意的是，达拉非尼的 RIP3 抑制似乎独立于其 B-Raf 抑制。达拉非尼被进一步揭示可防止对乙酰氨基酚诱导的正常人肝细胞坏死，这被认为是由 RIP3 介导的。在对乙酰氨基酚过量的小鼠模型中，发现达拉非尼明显减轻对乙酰氨基酚引起的肝损伤。结果表明抗癌 B-RafV600E抑制剂达拉非尼是一种 RIP3 抑制剂，可作为探索 RIP3 生物学的利器和潜在的预防或治疗与 RIP3 相关的坏死性凋亡相关疾病（如对乙酰氨基酚引起的肝损伤）的药物。

　　在这项研究中，我们建立了一种非放射性 RIP3 激酶测定法，并发现在八种测试的 Raf 抑制剂中，达拉非尼/泰菲乐对 RIP3 的抑制作用最强。通过 ATP 与酶蛋白的竞争性结合，达拉非尼以相对于其他 RIP 家族成员的高选择性抑制 RIP3。Dabrafenib 显然从 RIP3 介导的坏死性凋亡中拯救了细胞，这与其 B-Raf 抑制无关。此外，达拉非尼可减轻对乙酰氨基酚诱导的 RIP3 介导的人肝细胞或小鼠肝组织坏死损伤。

　　RIP3 介导的坏死性凋亡已被证明与多种病理状态有关。RIP3 敲除或沉默可以逆转或预防其中一些疾病或损伤，这表明 RIP3 抑制剂在临床上具有潜在的预防或治疗用途。目前仅报道了两种 RIP3 抑制剂（GSK'843 和 GSK'872），但这两种抑制剂只是用来探测RIP3在TLR3诱导的坏死中的作用；没有数据显示它们在 RIP3 相关疾病或损伤中的预防或治疗作用。因此，达拉非尼是第一个报道的小分子 RIP3 抑制剂，在 RIP3 介导的病理状态，即对乙酰氨基酚诱导的肝损伤中具有预防或治疗作用。达拉非尼已在临床上用于治疗其他疾病，表明其对人体的安全性是可以接受的。这显然提高了其预防或治疗 RIP3 相关疾病或损伤（包括对乙酰氨基酚过量肝毒性）的临床应用的可能性。

　　尽管 RIP1 和 RIP3 蛋白具有相似的一级序列，并且 RIP1、RIP3 和 B-Raf 蛋白具有相似的构象，但我们的数据显示 RIP1 抑制剂 necrostatin-1 不抑制 RIP3。测试的 B-Raf 抑制剂也显示出不同的 RIP3 抑制活性，这显然与它们的 Raf 抑制活性无关。Dabrafenib 显示出对 RIP3 和 Raf 激酶的有效抑制作用。此外，我们的数据显示，达拉非尼抑制 RIP3 独立于其对 B-Raf 家族成员的影响。因此，基于达拉非尼的结构，仔细的构效关系研究有助于区分有助于其 RIP3 抑制的部分和有助于其 Raf 抑制的部分。该研究结果可为今后开发高选择性RIP3或B-Raf抑制剂奠定重要基础。

　　此外，达拉非尼/泰菲乐和 vemurafenib 最近都被批准用于治疗携带 B-RafV600E的转移性黑色素瘤。达拉非尼对 B-Raf V600E的抑制作用是威罗非尼的 39 倍。然而，达拉非尼产生的临床治疗效果稍弱，皮肤鳞状细胞癌的发病率较低（发病率：达拉非尼 III 期试验中为6%，vemurafenib III 期试验中为 26%），这是 B-Raf 的常见副作用V600E抑制剂。达拉非尼抑制 RIP3 的效果也比威罗非尼强 27 倍，如发光测定法所确定的。2 种 B-Raf V600E抑制剂之间的这些差异似乎表明 RIP3 抑制可能对其治疗效果和毒性起作用，这值得澄清。在这方面，针对 RIP3 的 B-Raf 选择性抑制剂可能也有帮助。

　　最后，我们在本研究中建立的发光 RIP3 激酶测定具有几个优点。它具有与广泛使用的放射性 RIP3 激酶测定相当的高灵敏度。它是非放射性的，因此没有潜在的放射性污染和风险。该测定可以在相对较小的（10 μl) 384孔板系统，可满足小分子化合物高通量筛选的要求。使用该检测的重组 RIP3 是全长人 RIP3，它确保了化合物筛选结果与人体细胞或组织的高度相关性。此外，该测定中使用的所有其他材料或试剂都是常见的，并且很容易在商业上获得。所有这些优点表明，本研究中建立的这种 RIP3 激酶测定法有可能在未来被广泛使用。

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